浙江大学分子生物学实验重点

分子生物学实验课理论考试重点内容

载体（vector）: 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。

电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。

核酸限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，即是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性内切酶作用于磷酸二酯键，使双链DNA中两条单链上的3’,5’-磷酸二酯键断裂，产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH

Ⅱ类酶由两种酶组成及作用: 一种就是通常指的限制性内切酶，它识别并切割某一特异的DNA的核苷酸序列，产生特异的DNA片段；另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列,使A（嘌呤）甲基化。Ⅱ类酶中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础，绝大多数能识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5’- G↓AATTC-3’)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（3 ’突出和5 ’突出的单链末端）的DNA片段称粘性未端

可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的，且其识别序列一般大于6个碱基。

在适当的反应条件下（包括温度、pH、离子强度等），1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物所需要的限制性内切酶的量，定义为1个活性单位（1U)酶

影响限制性内切酶的活性的因素：DNA纯度、DNA的分子结构、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身

质粒的基本性质

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子,呈超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录的能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录主要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的

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抗性等。

质粒的两种类型：紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时，它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F因子。后者在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上, 质粒的不相容性：利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒中的一种，这种现象称质粒的不相容性。

碱法提质粒的原理：用含SDS的碱性溶液即溶液Ⅱ裂解大肠杆菌细胞，变性蛋白质和染色体DNA，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段, 碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状质粒DNA的两条链不会相互分开。然后用溶液Ⅲ中和提取液的pH以使质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，而线状染色体DNA片段难以复性，并与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起经离心沉淀，在溶液中只剩下质粒DNA和RNA。溶液中的RNA可用RNA酶A降解，从而使溶液中仅仅留下质粒DNA。

DNA片段琼脂糖凝胶电泳的原理：

核酸分子是两性解离分子，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在pH 值为8.0-8.3 时，核酸分子中碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与DNA分子大小及构像有关，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。

限制性内切酶反应的终止通常有以下三种方法：

1、采用65℃条件下温浴20min，通过加热失活内切酶；

2、加终止反应液（如0.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切酶变性以终止反应；

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3、通过电泳割胶回收或用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀，此法最为有效且有利于下一步的DNA的操作。

限制性内切酶用量：对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1 μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-5倍，反应时间也要适当延长，但过分加大酶量，甘油会影响反应外，酶本身会导致识别序列的特异性下降,产生酶的星号活力。 限制性内切酶的星号活力及其产生原因：

限制性内切酶在非标准的反应条件下，能切割一些与其识别序列类似的序列，这种现象称星号活力。每一种酶在特别的条件下均会产生这种活力。星号活力的识别形式常对标准识别序列中两侧的碱基没有特异性。

产生星号活力的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在

限制性内切酶酶切的限制性内切酶注意事项：

1．酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

2．进行DNA酶切时，要在其最适温度下(大多数为37℃)进行，最好使用每一种酶的专用缓冲液。当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割。

3．限制性内切酶一定要低温下贮存(－20℃)，以防止酶活性降低。

4．进行大量酶切时，先要确定限制性内切酶的浓度。一般来说，要用2-3倍才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。

5．琼脂糖凝胶的浓度直接影响DNA片段的分离效果，一定要根据被分离DNA片段的大小确定好合适的琼脂糖凝胶浓度。

6．EB是DNA的诱变剂具极强的致癌性，配制和使用过程中要特别小心，操作时要戴手套，有EB的废液和器皿要分别处理好。

7．大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于5％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

8．反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成

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粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。

9．酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

10．反应混合液中加入浓度为0.1 mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。

11．酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10 mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。

12．反应取酶时必须使用新的无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间，从冰箱中取出后，应置于冰上 …… 此处隐藏：13919字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……