高效液相色谱法测定猪肝组织中土霉素_四环素_金霉素残留量

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　　　　　　　　　　　　　　　分析仪器　　　　　　　　　　　　2009年第2期　

高效液相色谱法测定猪肝组织中

土霉素、四环素、金霉素残留量

林　玲　章程辉　程盛华　查玉兵　杨春亮

(中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001)

　　摘　要　建立了高效液相色谱法测定猪肝组织中四环素族抗生素留量的方法。通过对样品前处理方法进行优化,用固相萃取-高效液相色谱法同时测定了猪肝组织中土霉素、四环素、金霉素3种四环素族抗生素的残留量。μg/kg,相对标准偏差为3.02%～5.93该法对土霉素、四环素、金霉素的检出限分别为13、15、40

83%～90%。

关键词　高效液相色谱法　猪肝组织　四环素族抗生素

1　前　言

近年来(S)。TCS主要起疾病防治和促进生长的作用。但是这类药物长期使用就会在动物体内累积,从而在动物性食品中残留。若长期食用这些动物性食品及其制品就会危害人类的身体健康。四环素类药物的毒性反应主要表现在对胃、肠、肝脏的损害以及导致畸胎[1]。为了保证食品的卫生安全和提高我国食品在出口贸易中的竞争力,农业部对兽药中抗生素残留的最新限量为不超过0.1mg/kg[2]。目前四环素族抗生素的主要检测方法有高效液相色谱法[3-5]、微生物法[6]和分光光度法[7]。其中高效液相色谱法应用最多,但提取方法大多采用固相萃取柱净化(或双柱净化),操作步骤繁琐[4,8]。本文在文献[8]的基础上,改进了提取方法,用WatersC18固相萃取柱取代了OasisHLB固相萃取柱和CarboxylicAcid阴离子交换柱净化,流动相用乙腈-磷酸二氢钠溶液取代了乙腈-甲醇-0.01mol/L草酸溶液。实验表明,本法具有操作简便、检出限低、灵敏度高的优点,适于畜禽组织中四环素族类抗生素的检测。

;氮吹仪;WatersC18固相

(6mL,500mg);pH计。212　试剂与溶液

甲醇(色谱纯),乙腈(色谱纯),超纯水,草酸(分析纯),柠檬酸(分析纯)。

McI-Vaine溶液:称取28.41g磷酸二氢钠和21.01g柠檬酸,分别用水定容至1000mL,将625mL磷酸二氢钠和1000mL柠檬酸溶液混合,将pH调至4.00±0.03。

McI-Vaine-EDTA溶液:称取60.49g乙二胺

四乙酸二钠(Na2EDTA 2H2O),加到1625mLMcI-Vaine缓冲溶液中,使其溶解,摇匀。

草酸甲醇水溶液:称取1.50g草酸,用甲醇定容至100mL,混匀后,按1︰1比例用水稀释。

固相萃取洗脱液10mmol/L草酸甲醇溶液:称取0.387g草酸,用甲醇定容至300mL。

标准储备液:精密称取土霉素、四环素、金霉素标准品各0.010g,分别用甲醇溶解并定容至100

μg/mL。mL,浓度均为100

混合标准工作液:各取土霉素、四环素、金霉素标准储备液,用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作液。213　实验方法21311　样品前处理

2　实验部分

211　仪器设备

Waters高效液相色谱仪,配有自动进样器、四

样品提取:称取5～10g搅碎的猪肝样品于50mL聚四氟乙烯离心管中,加入McI-Vaine-EDTA

元泵、真空在线脱气机、二极管阵列检测器;离心机

作者简介:林玲,女,1978年8月出生,硕士,助理研究员,主要从事食品分析。E2mail:linling408@http://doc.guandang.net通讯作者:杨春亮,男,研究员。TeL:075922222446

　2009年第2期　　　　　　　　　　　　　分溶液15mL,在旋涡混合器上混匀2min,在离心机上离心10min,取上清液,残渣分别用15mL和10mLMcI-Vaine-EDTA溶液提取两次,离心,合并上清

析仪器

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于2.5时,柱效明显降低,拖尾加剧。这是因为四环素容易与金属离子形成螯合物,并在反相色谱柱的硅醇基上吸附。为了避免上述问题,常在流动相中加入各种酸,如磷酸、草酸、EDTA等,本实验选用磷酸调节,在pH为2.5时,色谱峰的分离效果最好,若pH太低,则易损坏色谱柱。314　线性范围和检出限用混合标准工作液配制成0.1、0.2、0.4、0.8、

μg/mL五种浓度的混合标准液。将不同浓1.0、2.0

,,,土量浓度在0.1～2.0,浓度与其峰面积呈良好线性关系。取标准谱图中一段比较平稳的基线以3倍信噪比计算各组分的最低检出限。土霉素、四环素、金霉素的线性回归方程、相关系数及检出限见表1。土霉素、四环素、金霉素的标准色谱图见图1。

表1　线性回归方程、相关系数和检出限化合物土霉素四环素金霉素

回归方程

y=34516x-4565.2y=20575x-5421.6y=10499x+125.7

液。

固相萃取净化:将WatersC18固相萃取柱依次用10mL甲醇、15mL水进行活化,然后将上清液过柱,用10mL超纯水洗柱,以无液滴滴下为止,用固相萃取洗脱液10mmol/L草酸甲醇溶液15mL进行洗脱,将洗脱液收集到试管中,于45℃下氮气吹干,用草酸甲醇水溶液2.0mL溶解残渣,供高效液相色谱仪分析。21312　色谱条件

色谱柱:SymmetryC18柱(4.μm);流动相:︰5

(pH2.5)=;;;μL:。进样量10

3　结果与讨论

311　样品提取液的选择

对高氯酸、甲醇、McI-Vaine-EDTA溶液作为

提取液进行了比较试验。结果表明,用高氯酸作提取液时,虽然可以沉淀样品中的蛋白,减少基质的干扰,但它对四环素族抗生素有较强的氧化性,对色谱柱也有一定的腐蚀性,影响了测定结果,故不宜选用。用甲醇作提取液时,虽然四环素族抗生素在甲醇中的溶解度比较大,但甲醇的提取效率不高。用McI-Vaine-EDTA溶液的提取效果良好,回收率高,故本法选用McI-Vaine-EDTA溶液作为提取液。312　分析波长的选择

用二极管阵列检测器对土霉素、四环素、金霉素的混合标准溶液进行扫描,结果发现土霉素、四环素和金霉素均在355nm处有最大吸收,故本法选用检测波长为355nm。313　流动相条件的选择

对流动相的配比和pH进行了比较试验。分别对流动相配比为乙腈+磷酸二氢钠(含0.01mol/L)=22+78、25+75、30+70、35+65进行了试验,从色谱图的分离效果看,乙腈+磷酸二氢钠=30+70时,分离效果和效率最佳。分别配制pH=4.0、3.0、2.5、2.0的NaH2PO4缓冲液,观察不同pH的流动相对分离效果的影响,结果表明:pH大

相关系数

(r)检出限(μg/kg)

0.030.050.

07

0.99950.99970.9993

图1　土霉素、四环素、金霉素的标准色谱图

11　土霉素　21四环素　31金霉素

315　方法的精密度和准确度

μg/mL的混合标准液10μL,按精确吸取1.6

2.3.2色谱条件平行测定5次,三种抗生素色谱峰的保留时间波动均小于0.1min,根据峰面积计算土霉素、四环素、金霉素的相对标准偏差RSD分别为

30

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氢钠溶液-乙腈(体积比70︰30)作为流动相,在pH

=2.5的条件下,3种组分均可达到基线完全分离。此方法灵敏度高,稳定性好,检出限低,重现性好,操作简便易行。

参考文献

1　叶树德,高世年.食品中兽药残留卫生技术.天津:天津

3.02%、4.82%、5.93%,表明方法的精密度良好,实

验结果准确可靠。

在未检出四环素族抗生素残留的猪肝样品中加

入一定量的四环素族抗生素,按样品测定方法平行测定3次,由测定结果计算回收率,结果见表2。土霉素、四环素、金霉素的回收率均在83%～90%之间,说明方法的准确度良好。

表2　样品加标回收率

(n=3)

科学技术出版社,1998:319

2　吉彩霓,岳振峰,谢丽琪等.中国兽医科技,2005,35

(10):820-826

化合物土霉素四环素金霉素

样品含量(μg/kg)

0.000.000.添加量

(μg/k …… 此处隐藏：3105字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……