金花茶体细胞胚胎_i_Cn-SERK__i_基因的克隆及其生物信息学分析

热带作物学报2013袁34渊9冤院1699-1707

金花茶体细胞胚胎Cn-SERK基因的

克隆及其生物信息学分析

翁浩袁赖钟雄*

福建农林大学园艺植物生物工程研究所袁福建福州350002

摘要以金花茶体细胞胚胎为材料袁采用RT-PCR和RACE技术袁获得了含有完整开放阅读框的金花茶Cn-

SERK基因cDNA全长序列和DNA全长序列遥Cn-SERK基因编码1个含有624个氨基酸的蛋白质遥生物信息学分析显示该蛋白质为亲水尧且具有信号肽的跨膜蛋白袁定位于内质网的可能性最高遥二级结构主要有琢螺旋和无规则卷曲构成袁存在1个蛋白激酶位点遥此蛋白可能发生磷酸化的位点有25个遥内含子分析结果表明袁Cn-SERK基因由11个外显子和10个内含子组成袁内含子的剪切位点符合真核生物GT-AG规则遥系统进化树分析结果表明袁金花茶Cn-SERK蛋白与毛果杨渊Populustrichocarpa冤的SERK亲缘关系较近遥关键词

金花茶曰体细胞胚胎曰Cn-SERK曰基因克隆曰生物信息学

S68曰Q78

文献标识码

A

中图分类号

CloningandBioinformaticsAnalysisofCn-SERKGenefrom

SomaticEmbryosinCamellianitidissimaChi.

InstituteofHorticulturalBiotechnology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China

WENGHao,LAIZhongxiong

AbstractThefull-lengthCn-SERKcDNAandgenomicDNAsequenceswereobtainedfromsomaticembryosusingRT-PCRandRACEtechniquesinCamellianitidissima.Chi.ThecDNAsequenceencodedapolypeptideof624aminoacids.Bioinformaticsanalysisshowedthattheproteinwasahydrophilicprotein,locatedinendoplasmicreticulum,withasignalpeptide.Thesecondarystructurewasmainlyconstitutedbythe琢-helixandrandomcoil,andthereexistedaproteinkinasesignatureand25phosphorylationsites.TheCn-SERKgenomicDNAsequencecontained11exonsand10introns.ThecleavagesiteoftheintronsconformedtotheGT-AGruleoftheeukaryotes.PhylogeneticanalysisalsoindicatedthattheCn-SERKwasclosetoSERKofPopulustrichocarpaingeneticrelationship.

KeywordsCamellianitidissima;Somaticembryos;Cn-SERK;Genecloning;Bioinformaticsdoi10.3969/j.issn.1000-2561.2013.09.014

金花茶渊CamellianitidissimaChi.冤属山茶科山茶属袁常绿灌木或小乔木袁花瓣蜡质呈金黄色遥金花茶资源稀少且繁殖速度慢袁被中国列为一级重点保护珍稀植物[1]遥在植物从体细胞胚胎发育成一个完整植株的过程中袁跨膜受体类蛋白激酶对细胞内外信号传导袁以及细胞与外界环境的交流起着重要的作用[2]遥富亮氨酸重复序列受体类蛋白激酶

渊Leucine-richrepeatsequencereceptor-likekinase袁LRR-RLK冤是跨膜受体类蛋白激酶多个亚家族之一[3]遥体细胞胚发生受体类激酶基因渊SERK冤为LRR-RLKs家族的第二亚类[4]遥Schmidt等[5]最早在胡萝卜渊Daucuscarota冤下胚轴的胚性细胞中发现SERK基因遥拟南芥渊Arabidopsisthaliana冤[6]尧苜蓿渊Medicagotruncatula冤[7]尧玉米渊Zeamays冤[8-9]尧水稻渊Oryzasativa冤[9]尧

向日葵渊Helianthusannuus冤[10]尧小麦渊Triticumaestivum冤[11]尧葡萄渊Vitisvinifera冤[12]等植物都有克隆到SERK基因袁但是目前在金花茶中还没有克隆出完整的SERK基因遥植物体胚发生是一个形态和生理生化变化的过程遥目前许多的研究结果表明SERK基因的表达对体胚发生有重要作用袁与无融合生殖关系密切袁可以作为体胚发生的标志基因[5袁13]遥在胡萝卜[14]愈伤诱导为胚性组织后袁可以检测到SERK基因遥魏丕伟[15]认为杂交鹅掌楸渊Liriodendronchinensis冤的SERK与体胚发生能力成正相关性袁而向日葵的SERK基因在体胚发生过程和器官发生过程中始终维持高水平表达袁推测其与体胚发生和器官发生的诱导有关[10]遥拟南芥AtSERK1的cDNA和35S的嵌合基因组组成表达使转基因细胞的体细胞胚诱导

收稿日期2012-12-04修回日期2013-07-01

基金项目福建省重大科技平台建设项目渊No.2008N2001冤曰国家科技支撑计划项目渊No.2007BAD07B01冤遥

作者简介翁浩渊1987年要冤袁男袁硕士研究生曰研究方向院花卉生物技术遥*通讯作者院赖钟雄袁E-mail院laizx01@http://doc.guandang.net遥

效率提高了4倍[6]遥本研究采用金花茶体细胞胚胎为材料袁进行SERK基因的克隆袁对其生物信息学以及结构进行分析袁预测其各种理化性质袁以及了解其结构特征袁分析其可能具有的功能袁能对试验的后续研究提供一定的参考袁对研究该基因在金花茶体胚发生中的具体作用奠定基础遥

热带作物学报第34卷

1.1材料

金花茶体细胞胚胎渊福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供冤曰PCR仪渊EPPENDORF冤曰RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKit渊Fermentas冤曰SystemforRapidAmplificationofcDNAEnds袁Version2.0渊Invitrogen冤曰Tripure渊Fermentas冤曰MarkerDL2000渊TaKaRa冤曰分析纯氯仿尧异丙醇尧乙醇渊国药试剂冤曰无RNA酶水渊Fermentas冤曰2伊TaqPCRMasterMix渊Thermo冤曰TAE电泳缓冲液曰pMD18-T载体渊TaKaRa冤曰pEASY-T5载体渊北京全式金冤曰琼脂糖曰无RNA酶处理的枪头尧离心管尧水遥1.2方法

1.2.1金花茶体细胞胚胎RNA和DNA的提取

利用Tripure方法进行总RNA的提取袁CTAB法提取DNA袁通过电泳检测RNA和DNA是否降

1材料与方法

解袁分光光度计测定RNA和DNA的纯度和浓度遥

采用1.2.2金花茶体细胞胚胎cDNA的合成

RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKit试剂盒合成第一链袁SystemforRapidAmplificationofcDNAEnds袁Version2.0试剂盒合成第二链遥

根据拟1.2.3金花茶Cn-SERK基因引物设计

南芥尧柑橘尧龙眼等的SERK基因序列比对结果袁在其保守区域设计上下游引物遥3忆RACE的特异引物是以克隆金花茶Cn-SERK基因得到的保守区设计2条正向引物遥5忆RACE的特异引物是以保守区和3忆端拼接后的序列设计的2条反向引物遥开放阅读框引物根据开放阅读框的起始和终止的位置设计袁或者是在3忆和5忆的UTR部分设计均可遥以得到的Cn-SERK基因cDNA全长序列设计克隆Cn-SERK基因DNA所需引物渊表1冤遥

1.2.4目的片段的扩增PCR扩增体系为25滋L袁程序为院94益预变性2min曰94益变性40s袁退火温度为引物合成单上的温度渊时间为40s冤袁72益延伸渊延伸时间按1min延伸1kb的速率计算冤袁35个循环曰72益总延伸10min遥

根据实1.2.5产物的回收尧连接尧转化尧测序

验室具有的试剂盒袁进行产物的回收尧连接和转化袁菌液送华大基因有限公司测序遥

表1所用引物及其序列

引物名称

引物序列

cDNA

5忆Cn-SERKR2:5忆-GTTCCACCATCAACAATCTC-3忆ORF-F:5忆-CAATAGATGAGAGGTAGAGTGG-3忆ORF-R:5忆-TCATCTTGGCCCGGACAATTC-3忆SERKP2R:5忆-TGCTGCATTTCCAAGATC-3忆

5忆Cn-SERKR1:5忆-GGAATGGAACCAGAAAGGCT-3忆

3忆Cn-SERKF2:5忆-GAAGGAAACCACATGAACA-3忆

3忆Cn-SERKF1:5忆-GTTCCACCATCAACAATCTC-3忆

Cn-SERKR:5忆-GGTAAGGTGTACAAGGGATGC-3忆

Cn-SERKF:5忆-GATCTTGNAAATGCNGCTTTGTC-3忆

SERKP1F:5忆-CAATAGATGAGAGGTAGAGTGG-3忆

SERKP4R:5忆-CAAGTANAGATCCAAGCTCAC-3忆SERKP5F:5忆-GTGAGCTTGGATCTNTACTTG-3忆

基因组DNA

SERKP7F:5忆-TGGTTCCATTCCTATGTCCT-3忆SERKP6R:5忆-GGAATGGAACCAGAAAGGCT-3忆 …… 此处隐藏：19667字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……