2006巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶

2006巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶

第33卷第6期

2006

年北京化工大学学报

JOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFCHEMICALTECHNOLOGY

Vol.33,No.6

2006

巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶

陈晶晶　陈劲春3

(北京化工大学生命科学与技术学院,北京　100029)

摘　要:对巴斯德毕赤酵母GS115菌株在工业培养基中发酵和分离条件进行了研究。结果表明:将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至35g/L和5g/L时,,但培养时间可减少4h,节省了生产成本;维持诱导期间的pH值为410对目标蛋白的表达最有利,酵母分泌蛋白总量的70%,比原来增加了近30%;分离纯化过程,()交换层析柱偶联的分离方法,达到除杂,并浓缩目标蛋白的作用,50;,质量酶活性为8156×10-3mol/(s g)。

关键词:人溶菌酶;毕赤酵母;发酵;分离纯化中图分类号:Q786

　　,蛋。人溶菌酶(HLZ)是人体内的一种蛋白质,和人体具有天然相容性,临床上应用时,比其他溶菌酶更安全,没有刺激性和副作用[1]。此外,溶菌酶作为食品防腐剂和婴儿食品添加剂,已在食品工业上得到广泛应用[2]。HLZ的溶菌活性比蛋清溶菌酶高出3倍,且热稳定性也高于蛋清溶菌酶的热稳定性[3]。

国内利用毕赤酵母发酵生产HLZ的研究还比较少,有利用大肠杆菌和真菌表达系统的报道,表达最高水平为40mg/L[4]。国外有采用毕赤酵母发酵生产蛋清溶菌酶的报道[5],但没有对HLZ的表达进行进一步研究。本文针对传统工业培养基中碳源、氮源的质量浓度和诱导期间的pH值对重组HLZ表达量的影响进行了研究,提高了重组HLZ的产量,为今后实现重组人溶菌酶的工业化生产提供了参考依据。

GS115,为本实验室保存。

11112　培养基　酵母培养基YPG(质量分数):1%

酵母提取物,2%大豆蛋白胨,1%甘油。工业培养基(g/L):二水硫酸钙0193,硫酸钾1812,七水硫酸镁1419,甘油35,硫酸铵5,柠檬酸三钠1147,011mol/L

的pH值610磷酸钾缓冲液。微量元素(PTM)(g/L):五水硫酸铜610,碘化钾018,一水硫酸锰310,二水钼酸钠012,硼酸012,氯化钴015,氯化锌2010,七水硫酸亚铁6510,生物素012,浓硫酸510mL/L。试剂均为国产生化试剂纯或分析纯。11113　其他材料　SPFF强阳/DEAE弱阴离子交

换层析柱和填料均购自AmershamBiosciences公司。中空纤维膜购自天津膜公司,酵母型重组肠激酶购自罗氏公司,10k透析袋购自北京泽平科技有限公司。112　方法

11211　培养方法　将保存的菌种接到YPG培养基

中,28℃和200r/min的条件下振荡培养12h,然后以5%的接种量转接到工业培养基中,在28℃和200r/min的条件下振荡培养。期间,用氨水调节培

1　材料与方法

111　材料

11111　菌种　含人溶菌酶基因的PichiaPastoris

收稿日期:2005212215

第一作者:女,1981年生,硕士生3通讯联系人

E2mail:jingchunchen@http://www.77cn.com.cn

养基的pH值使之保持在515,待甘油耗尽后,饥饿1～2h开始诱导。诱导期调节pH维持在410,每12h补加体积分数015%的甲醇诱导,诱导84h后停

止发酵。

11212　分析方法　将菌液稀释后于波长600nm处

以去离子水为参比,用比色法测定溶液吸光度;测定所取发酵液中的细胞干质量,再除以所取发酵液体

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第6期　　　　　　　　　　　　陈晶晶等:巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶 35

积即得细胞质量浓度;甘油浓度用高碘酸钠氧化法测定[6];发酵液中总蛋白浓度测定参考考马斯亮蓝染色法[7];发酵液中目标蛋白(重组人溶菌酶原)浓度的测定法是取发酵液离心后的上清走SDS2PAGE,将凝胶进行计算机扫描分析,用BIO2PRINT凝胶成像与分析系统分析目标蛋白的含量,根据考马斯亮蓝染色法测定的发酵液中总蛋白的量推算出目标蛋白浓度。

11213　分离方法　将发酵液离心,收集上清液,用6k～30k的中空纤维膜截留。让收集的蛋白溶液

[8]

故将工业培养基中甘油质量浓度降低至35g/L。

表2　(NH4)2SO4质量浓度对细胞吸光度A600的影响

Table2　Effectof(NH4)2SO4concentrationon

cellabsorbencyA600

ρ((NH4)2SO4)/(g/L)

4578A600

39.849.843.8743.3

先流过SPFF强阳离子交换层析柱,洗脱收集的蛋白液再流过DEAE弱阴离子交换层析柱,收集洗脱峰。强阳离子交换步骤,采用磷酸缓冲体系,pH为710;弱阴离子交换步骤,采用Tris系,pH值为810。到的蛋白液用12。11214　

溶液按体积比(1μL酶可以切15mg目标蛋

,当H245g/L

,,适当的减。故(NH4)2SO4质量浓度降低至5g/L。21112　诱导期间pH值的优化　诱导期间考察pH

白计算加酶量)混和均匀,20℃下,酶切8～12h。10倍酶切缓冲体系参见商品化酵母型肠激酶使用说明书。

11215　酶活力测定方法　采用热激法(煮沸裂解

值在315～710范围内对诱导的影响。如图1所示,pH410处目标蛋白条带最清晰,因此维持诱导期间的pH值为410对目标蛋白的表达最有利。此结果表明,在酸性环境中更有利于酵母对碱性蛋白的表达。

法)[9]和溶壁微球菌比浊法[10]测定酶活。

2　结果与讨论

211　发酵条件的优化

因为细胞吸光度与细胞质量浓度成直线关系,故在实际应用中就用细胞吸光度来反映发酵液中细胞质量浓度的大小。

21111　工业培养基中碳源和氮源的优化　在传统

图1　诱导期间不同pH值对目标蛋白表达的

SDS2PAGE电泳图谱分析

Fig.1　SDS2PAGEanalysisofeffectofpHonexpression

oftargetproteinduringtheinductionperiod

工业培养基基础上,对甘油和硫酸铵质量浓度分别进行优化。结果如表1和表2所示。

表1　甘油质量浓度对细胞吸光度

A600的影响

Table1　EffectofglycerolconcentrationoncellabsorbencyA600ρ(甘油)/(g/L)

2025303540

A212　分离纯化结果

/h

2833343640

28.837.344.551.252.0

如图2所示,洗脱峰1中目标蛋白(16k附近)

电泳条带较浅,杂蛋白(43k附近)条带较深,说明只用SPFF强阳离子交换层析柱分离得到的目标蛋白含量不高;洗脱峰2中目标蛋白(16k附近)条带较深,杂蛋白(43k附近)条带较浅,说明再用一步DEAE弱阴离子交换层析柱可以进一步除去杂蛋

由表1可见,将甘油质量浓度由35g/L增加到40g/L时,菌体吸光度的增长不大,而适当的降低甘油添加量有助于缩短培养时间,进而降低发酵成本。

白,并将目标蛋白浓缩。213　酶切结果

如图3所示,目标蛋白条带在16k附近,而经重组肠激酶酶切后的重组人溶菌酶条带在1414k

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36 北京化工大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　2006年

能得到了有活性的人溶菌酶。

(a)去离子水;(b)人溶菌酶标准品;(c)经重组肠激酶酶切后的重

1—超滤后的上清液经SPFF强阳离子交换层析后的洗脱峰1;2—洗脱峰1中的收集液经DEAE

弱阴离子交换层析后的洗脱峰2

组人溶菌酶;(d)目标蛋白

图4　4on

E.coli

图2　SP2SepharoseFF洗脱峰1和DEAE2SepharoseFF

洗脱峰2蛋白组分的SDS2PAGE电泳图谱

Fig.2　SDS2PAGEanalysisofelutionand

elutionpeak2

2用电镜观察热激法处理前后的

,结果如图

5所示。

附近,且16k,。

1—目标蛋白;2—经重组肠激酶 …… 此处隐藏：4961字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……