蛋白质组学技术研究进展及应用

蛋白质组学技术研究进展及应用

蛋白质组学技术研究进展及应用

随着基因组学研究的深入，人们发现基因组学存在一定的局限性，在这种背景下，20世纪90年代产生了一门以蛋白质组为研究对象，在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质学。随着人类基因组草图2001年的正式发表和2003年4月的最终完成，科学家们又进一步提出了后基因组计划，蛋白质组(proteome)研究便是其中一个很重要的内容。蛋白质组学(Proteomics)是作为功能基因组学的重要支柱，并已同基因组学(Genomics)和生物信息学(Bioinformatics)一起成为新世纪生命科学研究的前沿和热门领域，Nature，Science杂志在公布基因组序列草图的同时，分别发表了述评和展望，将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度，认为它是功能基因组学前沿研究的战略制高点和新世纪最大的战略资源——“有用基因”争夺战的重要“战场”。

1 蛋白质组学的概念、研究内容及意义

蛋白质组(proteome)源于protein和genome两词的杂合，最早是由澳大利亚的WILKINS等于1995年提出，其定义为“一种基因组所表达的全部蛋白质”。因蛋白质组具有时空性和可调节性，蛋白质组的概念实际指在特定时刻、特定环境和实验条件下基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析，通过对某种物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质(包括表达水平、结构、分布、功能、丰度变化、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与疾病的关联性)的研究，对蛋白功能做出精细和准确的阐述。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理或病理状态中，发生的相应的变化。

蛋白质组学的研究内容主要有两方面：结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。常规的方法是提取蛋白质，经2-DE(two dimensional electrophoresis)分离形成一个蛋白质dimensional electrophoresis)分离形成一个蛋白质组的二维图谱，通过计算机图像分析得到各蛋白质的等电点、分子量、表达量等，再结合以质谱分析为主要手段的蛋白质鉴定，建立起细胞或组织或机体在所谓“正常生理条件下”蛋白质图谱和数据库。然而，在此基础上，可以比较分析在变化了的条件下，蛋白质组所发生的变化，如蛋白质表达量的变化、翻译后的加工修饰、蛋白质在亚细胞水平上的改变等，从而发现和鉴定出特定功能的蛋白及其基因。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用。蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标，目前主要集中于研究蛋白质相互作用和蛋白质结构与功能的关系，以及基因的结构与蛋白质的结构功能的关系。对蛋白质组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要部分，它要求对蛋白质进行表征即对所有蛋白质进行分离、鉴定及图谱化。蛋白质间的相互作用主要包括以下几类：分子和亚基的聚合；分子杂交；分子识别；分子自组装；多酶复合体，而分析一个蛋白质和已知功能的蛋白质相互作用是研究其功能的重要方法。

2 蛋白质组学相关技术

蛋白质组学研究的首要任务是建立获取和分析蛋白质的常规、可靠、有效的技术。为达到这一要求，就需要样品准备、数据获取标准化及自动化，也就是要有可重复的高通量的技术。蛋白质组研究的技术手段在不断完善，其工作流程是多步骤进行，包括蛋白质样本的制备、

蛋白质组学技术研究进展及应用

分离、定量及鉴定。由双向凝胶电泳、质谱技术、酵母双杂交系统、蛋白质微阵列技术、能进行大规模数据处理的计算机系统和软件、软电离技术及生物信息学技术构成了蛋白质组学研究的主要技术体系。

现阶段蛋白质组的研究可分为3个主要步骤：应用双向凝胶电泳、“双向”高效柱层析分离蛋白质；应用氨基酸组成分析、C2或N2末端氨基酸序列分析及质谱分析鉴定所分离的蛋白质；应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。所以目前蛋白质组研究技术可以分为以下几个方面。

2.1 蛋白质分离技术

2.1.1 样品制备技术

蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。蛋白质样品制备的一般过程是：对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原，断开蛋白质之间的连接键，提取全部蛋白质，除去非蛋白质部分。样品制备时必须注意：简化样品处理过程，避免蛋白丢失；减少蛋白降解；避免样品的反复冻融；防止各种可能的非目标性蛋白修饰；保证清除所有杂质；新鲜制备样品裂解液。对较为特殊的样品，必要时采用特殊助溶剂或分步提取等制备方法。在进行植物蛋白质组的研究中，已有多种蛋白质提取方法应用于不同植物的蛋白质制样中，例如：硫酸铵沉淀法、三氯乙酸(TCA)沉淀法、丙酮沉淀法、TCA-丙酮沉淀法以及用饱和酚提取，在甲醇中以醋酸铵沉淀的方法等，这些制样方法各有利弊，其中，又以TCA-丙酮沉淀法应用较多。但是，由于植物材料，特别是适应恶劣自然环境的植物叶片中常含有大量色素、酚类、有机酸、脂类及其他次生代谢产物，这些物质常常会干扰叶片蛋白质的提取分离及后续分析。所以，应该根据自己的材料与实验要求在前人提取方法的基础上，通过对比试验，建立起适合自己的蛋白质提取方法。此外，无论进行蛋白质组研究还是亚蛋白质组分析，制备样品的过程必须是可重复的，且适合于随后的蛋白质分离和鉴定。

2.1.2 双向凝胶电泳

分离技术是蛋白质组学研究的核心，双向凝胶电泳是由SMITHIEA和POULIK在1956年发明的，并于1975年由O’'FARRELL做了改进，并建立起了双向凝胶电泳技术体系。以双向凝胶电泳技术为主要手段，双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE)对蛋白进行分离的原理是：第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度进行分离，至各自的等电点；再根据分子量的不同，在第一向基础上，通过聚丙烯酰胺垂直的方向电泳进行分离。但目前该系统还面临着一些方法上的问题：疏水性蛋白(如膜蛋白)难溶于样品缓冲液；高分子量蛋白、极酸和极碱性蛋白易在电泳中丢失；低拷贝(拷贝数小于1000)蛋白无法检测等。2D-PAGE是蛋白质组学研究的关键技术，而2D-DIGE (two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis)则在其基础上做了重大的改进。

2D-DIGE在分离蛋白前，先用荧光素将蛋白样本作上标记，分离后再用质谱进行分析，这种方法可以对实验组和对照组的蛋白质的表达，进行精确且可重复的定量分析。2-DE获得的数据可以用专门的系统管理。如：PARIS(proteomic analysis and resources indexation system)系统，它储存了电泳图像和信息，供研究者搜索应用。

蛋白质组学技术研究进展及应用

2.1.3 高效液相层析(HPLC)

虽然HPLC在蛋白组分析中未能广泛应用，但其作为分离蛋白质的第一步，仍具有很好的前景。双向高效液相层析(2D-HPLC)也是一种很好的蛋白质分离纯化方法。其第一相根据分子大小分离蛋白质，第二相是 …… 此处隐藏：10178字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……