RT-PCR和Q-PCR及数据处理

RT-PCR和Q-PCR

1、细菌总RNA反转录（RT-PCR）

1.在冰上融化RNA模板。在室温(15-25℃)下解冻gDNAWipeoutBuffer,Quantiscript逆转录酶,QuantiscriptRTBuffer,RTPrimerMix,RNase-freewater。将每份溶液震荡混合于管中。离心机短暂离心并收集管中残余液体,然后放置于冰上。

2.根据表2-2，在冰上准备基因组DNA消除反应。混合。

注意:如果设置多个反应,准备一个主要的混合gDNAWipeoutBuffer和RNase-freewater体积大于10%,所需反应的总数。适当分配主要混合液于几个管,然后向单管中加入RNA样本。

注意:这份成分表适用的RNA量是10pg至1µg。如果使用>1µg的RNA,则反应规模成线性增长。例如,如果使用2µgRNA，则每个成分变成双倍，最后总体积成28µl。

表2-2.基因组DNA消除反应成分

Tabel2-2GenomicDNAeliminationreactioncomponents

成分

gDNAWipeoutBuffer模板的RNA（最高用量为1µg）RNase-freewater总反应体积

体积/反应7×2µl适量(5µl)适量(7µl)14µl

*此数量包含所有RNA,包括任何rRNA,信使核糖核酸、病毒RNA,和载体RNA,无论使用的

引物、cDNA分析。

3.在42℃孵化2分钟,然后立即放置于冰上。

注意:不要在42℃培养超过10分钟

4.根据表2-2准备反转录混合液（thereverse-transcriptionmastermix）于冰上。混匀,然后保持在冰上。反转录混合液包含所有合成第一条cDNA所需的成分，但除了模板RNA。

注意:如果设置多个反应,准备主混合10%的体积大于所需反应的总数。分配适当的体积成单个管。

注意:如果使用>1µg的RNA,则反应规模成线性增长。例如,如果使用2µgRNA，则每个成分变成双倍，最后总体积成40µl。

表2-3.Reverse-transcripition反应成分

Tabel2-3.Reverse-transcripitionreactioncomponents

成分体积/反应

Reverse-transcriptionmastermix，1µlQuantiscriptReverseTranscriptaseQuantiscriptRTBuffer,5x

4µl

RTPrimerMix

模版RNA,Entiregenomiceliminationreaction终反应体积

1µl

DNA14µl(被添加在步骤5)

20µl

*还含有RNA酶抑制剂。①包括Mg2+和dNTPs.

②如果RTPrimerMix用于逆转录，为了方便,以1:4比例预混合RTPrimerMix和5xQuantiscriptRTBuffer。本预混料储存在-20℃时是稳定的。每20µl反应体系使用5µl预混料。

5.从步骤3添加模板RNA(14µl)到每个管，其中包含反转录混合液。混匀,然后放置在冰上。

6.在42℃孵育15分钟。

注意:在一些罕见的情况下(如果RT-PCR产品超过200个bp或者分析的RNA具有高度的二级结构),提高孵化时间至30min可能会增加cDNA产率。

7.在95℃保温3分钟，使Quantiscript逆转录酶的失活。

8.使reverse-transcription反应在冰上进行,直接进行实时PCR。若要长期储存,储存reverse-transcription反应应在-20℃。

注意:关于进行real-timePCR反转录操作后的详细信息,请参考AppendixCoftheQuantiTectReverseTranscriptionHandbook。适当控制的详细信息,请参阅AppendixD.进行real-timePCR我们建议使用Rotor-GeneKit,QuantiFastKit,或者QuantiTectKit。

9.为了检验反转录的得到的cDNA是否可以在接下来实验中使用，可以通过普通PCR检测cDNA质量。

2、Q-PCR

QuantiFastSYBRGreenPCRKit为两步循环方案，分别为95℃的变性阶段和60℃的联合退火/延伸阶段。该方案对Tm值在60℃以下的引物有效。为了使SYBRGreen发挥高效作用，目的序列应当在60-200bp之间。该PCR过程必须以95℃作为第一步的起始孵育反应，以活化HotStarTaqPlusDNAPolymerase.对于96孔板，我们建议使用25μl的体系。以在2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix提供的Mg浓度为起始浓度若使用QuantiTectPrimerAssays，反应的终浓度为1x。并且，遵照表二中的循环方案。若使用iCycleriQ,iQ5或者MyiQ，合适的反应条件必须在每个实验开始前摸索清楚，这样可以弥补因加样吹打不均匀而造成的缺陷。步骤

1.溶解2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix，模版DNA，cDNA引物，RNase-freewater。将每个反应体系混匀。

2.按照表2-4准备好反应混合液。因为反应的起始是高温，所以并不需要在冰上进行操作或者在设计RT循环冰浴。

注意：我们强烈建议以2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix提供的Mg2+浓度为起始浓度。

将每个反应充分混匀，并在PCR管中分别添加合适体积反应。

表2-496孔板反应体系

Tabel2-4The96holeplatereactionsystem

成分

体积

终浓度1×

2+

2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix12.5μl

PrimerA*PrimerB*

模版DNA或者cDNA(第四步添加)

适量适量适量

1μM1μM

≤100ng/反应

RNase-freewater反应终体积

适量25μl

3.添加模版DNA或者cDNA（≤100ng/反应）在每个单独的含有反应试剂的

PCR管中。

对于两步RT-PCR，cDNA的添加体积（从未经纯化的RT反应中）不应超过PCR终体积的10%。

4.通过表2-5中的计划纲要，计划你的RT循环。数据的收集应该在联合退火延伸阶段进行。

5.将PCR管放在RT循环中，开始这个循环程序。

表2-5RT循环条件

Tabel2-5TheRTCyclingconditions

步骤PCR初始活化

时间5min

温度95℃

缓变率

最高值/快速模式

其他事项

加热以活化HotStarTaqPlusDNAPolymerase

两步循环变性

15s

95℃55℃

最高值/快速模式最高值/快速模式

收集处理荧光数据

联合退火/延1min伸循环数目

40

循环数目参照模版DNA数目

6、进行熔解曲线曲线分析以验证PCR产物的特一性和同一性。熔解曲线分析是在RT循环程序中自带的软件，请遵照供应商提供的说明书进行。

7、琼脂糖电泳检测PCR产物的特一性。

3、数据处理

萘诱导处理后的赤红球菌RHD基因的表达数据经AppliedBiosystems7500软件呈现后采用ΔΔCT方法计算。

起始模板的相对含量比为

（1为检测基因，2为内参因子）。

不同样品间检测基因的相对表达量差异，即

（1为检测样品；2为对照样品），所得

的比值即为检测基因在不同样品间的表达量差异。