新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测(2)

第4期

芦 静等: 新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测

表1 分子标记PCR引物序列

Table 1 PCR primers of molecular markers used in the study

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标记 Marker By8 By9 Bx7 Dx5 1B·1R

引物序列

Forward and reverse primers (5'–3')

F: TTAGCGCTAAGTGCCGTCT; R: TTGTCCTATTTGCTGCCCTT F: TTCTCTGCATCAGTCAGGA; R: AGAGAAGCTGTGTAATGCC F: CGCAACAGCCAGGACAATT; R: AGAGTTCTATCACTGCCTGGT F: CGTCCCTATAAAAGCCTAGC; R: AGTATGAAACCTGCTGCGGAC F: GGAGACATCATGAAACATTTG; R: CTGTTGTTGGGCAGAAAG

等位基因Allele By8 By9 Bx7 Dx5 Glu-B3j Ppo-A1 Ppo-D1aPpo-D1bPsy-A1

片段大小 Fragment size (bp)

527 662/707 630/766 450 1500 685/876 713 490 194/231

文献 Reference Lei et al. [7] Lei et al. [7] Ma et al. [5] D’Ovidio et al. [6]Francis et al. [12]Sun et al. [16] He et al. [17] He et al. [17] He et al. [21]

PPO18 F: AACTGCTGGCTCTTCTTCCCA; R: AAGAAGTTGCCCATGTCCGC PPO16 F: TGCTGACCGACCTTGACTCC; R: CTCGTCACCGTCACCCGTAT PPO29 F: TGAAGCTGCCGGTCATCTAC; R: AAGTTGCCCATGTCCTCGCC YP7A

F: GGACCTTGCTGATGACCGAG; R: TGACGGTCTGAAGTGAGAATGA

循环; 72℃延伸5 min。By9的扩增程序为95℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 59℃退火30 s, 72℃延伸1 min 30 s, 37个循环; 72℃延伸5 min。1B·1R的扩增程序为94℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 58℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 35个循环; 72℃延伸5 min。PPO18的扩增程序为94℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 65℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 35个循环; 72℃延伸7 min。PPO16的PCR反应采用步降退火程序, 首先95℃ 5 min; 然后95℃ 30 s, 由66℃开始, 每个循环的退火温度降低0.3℃, 退火时间30 s, 72℃延伸1 min, 共40个循环; 最后72℃延伸5 min。PPO29的扩增程序为: 95℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 65℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35个循环; 72℃延伸5 min。YP7A的扩增程序为95℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 65℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35个循环; 72℃延伸5 min。

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离, 采用缓冲体系1×TAE溶液, 180~200 V电压电泳30 min, 0.5%溴化乙锭(ethidium bromide, EB)染色10 min, 蒸馏水漂洗后在GelDoc XR System成像系统上用紫外灯扫描成像并存入计算机。分析特异性条带。

43.1%和42.3%, 国外品种为14.3%和44.0%; 国外品种出现Bx6+By8亚基的频率为20.9%, 而其他国内品种与新疆当地品种中出现Bx6+By8的频率低于5.0%。Glu-D1位点有8种类型, Dx2+Dy12和Dx5+Dy10占主导地位; Dx2+Dy12有177份, 新疆当地品种、其他国内品种和国外品种中的频率分别为63.0%、53.8%和48.4%, Dx5+Dy10有117份, 其频率分别为33.0%、35.4%和41.8%(表2)。可见, 321份材料的高分子量谷蛋白亚基变异类型丰富, 但各亚基类型出现频率差异较大, 不同来源材料出现的亚基变异不尽相同, 在Glu-B1和G1u-D1位点国外品种的亚基变异比较丰富, 新疆当地品种在这两个位点与国内外品种有一定差别。Dx5+Dy10为优质亚基, 国外品种出现频率高于中国品种。发现了13+16、8和5+10等非常少见的亚基, 新疆品系01/2153的亚基组成为1、8和5+10, 北京品种京农98-K143的亚基组成为null、13+16和2+12, 加拿大品种Canada 138的亚基组成为null、17+18和5。

2.2 高分子量谷蛋白亚基的分子标记和SDS- PAGE结果比较

高分子量谷蛋白亚基特异引物检测结果表明, 在Glu-D1位点上, Dx5的标记在含Dx5基因的材料中扩增出450 bp的条带(图1), Bx7基因的引物在Glu-B1位点含Bx7的材料中可扩增出630 bp和766 bp两条带, By8基因的引物在Glu-B1位点含By8的材料中可扩增出527 bp的条带, By9基因的引物在Glu-B1位点可扩增出707 bp和662 bp带型, 含By9的材料中可扩增出662 bp的条带。扩增条带清晰, 重复性好。

利用PCR特异引物检测, Dx5亚基扩增出450 bp片段的品种有123份, 频率为38.3%; Bx7亚基扩增

2 结果与分析

2.1 高分子谷蛋白亚基SDS-PAGE结果的等位变异分析

321份材料中, 在3个位点共检测出21种亚基, 其中Glu-A1位点有3种类型, 以null为主, 在新疆当地品种、其他国内品种和国外品种中的频率分别为60.0%、68.5%和70.3%。G1u-B1位点有10种类型, Bx7+By8和Bx7+By9亚基占主导地位, 新疆当地品种中的频率为41.0%和46.0%, 其他国内品种为

新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测

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作 物 学 报

表2 供试材料HMW-GS在不同位点上的变异类型及其频率

Table 2 Allelic variants and their frequencies at Glu-1 loci in the tested materials (%)

基因位点 Locus Glu-A1

第35卷

亚基 新疆当地品种 其他国内品种 国外品种 均值 Subunit Xinjiang local cultivar Other Chinese cultivarOversea cultivar Mean 1 24.0 23.1 17.6 21.8 *

2 16.0 8.5 12.1 11.8 null 60.0 68.5 70.3 66.4

Glu-B1

7 2.0 8.5 11.0 7.2 7+8 41.0 43.1 14.3 34.3 7+9 46.0 42.3 44.0 43.9 6+8 5.0 2.3 20.9 8.4 6+9 0 0 1.1 0.3 14+15 1.0 1.5 3.3 1.9 17+18 3.0 1.5 3.3 2.5 20 1.0 0 2.2 0.9 13+16 0 0.8 0 0.3 8 1.0 0 0 0.3

Glu-D1

2+10 0 0.8 2.2 0.9 2+11 3.0 0.8 2.2 1.9 2+12 63.0 53.8 48.4 55.1 3+12 1.0 0.8 2.2 1.2 4+12 0 5.4 0 2.2 5+12 0 0.8 2.2 0.9 5 3.0 0.8 2.2 1.9 5+10 33.0 35.4 41.8 36.4

出630 bp和766 bp两条带的有275份, 频率为85.7%; By8亚基扩增出527 bp的条带有125份, 频率为38.7%; Bx9亚基扩增出662 bp的条带有137份, 频率为42.7%。比较特异性PCR标记扩增与SDS-PAGE电泳鉴定结果, Dx5、Bx7、By8和By9亚基的吻合率

分别为97.2%、98.4%、93.4%和97.2%。从PCR特异引物扩增的4个高分子谷蛋白亚基来看, 两种亚基检测结果存在一定的差异, 但总体吻合率较高, 用已开发出的蛋白亚基特异性引物对小麦品种进行检测, 其可靠性和准确性是有保障的。

表3 供试品种的HMW-GS的PCR检测与SDS-PAG检测结果比较

Table 3 Comparison of the results for HMW-GS tested by PCR markers and SDS-PAGE

检测方法 Method PCR

亚基 Subunit Dx5 Bx7 By8 Bx9

材料数 频率 Accession number Frequency (%)

123 38.3 275 85.7 125 38.9 137 42.7

SDS-PAGE

Dx5 Bx7 By8 Bx9

124 38.6 274 85.4 138 43.0 142 44.2

图1 Dx5 亚基特异性PCR标记对供试材料的扩增结果

Fig. 1 PCR products amplified by Dx5 specific PCR marker in winter wheat cultivars

M: DL 2000; 1: 新冬18; 2: 新冬20; 3: 新冬24; 4: 新冬22; 5: 新冬28; 6: 新冬23; 7: 中优16; 8: 豫麦13; 9: 新冬19; 10: 新冬17; 11: 豫麦34; 12: 新春21; 13: 新春14; 14: 新春6号; 15: 新春2号。

M: DL 2000; 1: Xindong 18; 2: Xindong 20; 3: Xindong 24; 4: Xindong 22; 5: Xindong 28; 6: Xindong 23; 7: Zhongyou 16; 8: Yumai 13;

9: Xindong 19; 10: Xindong 17; 11: Yumai 34; 12: Xinchun 21; 13: Xinchun 14; 14: Xinchun 6; 15 …… 此处隐藏：4547字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……