东洋纺突变试剂盒说明书(2)

（４）PCR过程中的第二位点突变（目标突变以外的突变）

本试剂盒采用了保真度极高的KOD –Plus-酶， PCR的循环数也尽可能减少，通常不会产生第二位点突变。但是即使其发生概率极低，第二位点突变也不可能完全避免，而且引物合成时也有可能摄入错误的碱基。因此，在突变体用于后续实验之前，请对突变体进行测序，以确认其序列。

（５）对照质粒

本试剂盒中含有对照质粒（pAK119M），其LacZ基因已经突变，第6个氨基酸密码子突变为TAA（终止密码子）。当被转化入大肠杆菌后，在X-Gal板上形成白色菌落。利用试剂盒添附的对照引物进行突变反应后，该密码子可从TAA（终止密码子）恢复为CCA（Pro），转化后可在X-Gal板上产生蓝色菌落（图三），这样就可以简单地确认突变反应是否正确进行。根据本实验操作步骤进行该突变反应，通常可获得80％以上的蓝色菌落。

该对照质粒含氨苄青霉素和卡那霉素两种抗性。

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[５] 操作说明

（１）反向PCR

① 将引物都稀释为10pmol/ul，模板质粒DNA浓度调整至50ng/ul。

② 按以下配比配制PCR反应液。

灭菌蒸馏水 35ul

10×Buffer for iPCR

2 mM dNTPs 5ul5ul

引物1（10 pmol/ul） 1.5ul

引物2（10 pmol/ul） 1.5ul

Plasmid DNA（50ng/ul） 1ul

KOD -Plus-

Total Volume 1ul50ul

③ 按以下条件进行PCR。

94℃ 2 min

98℃

sec

68℃min4℃ Hold 注1）延伸时间可按1min/kb5min。

注2）循环数可按1循环/kbPCR的循环数为10～20个循环，可分别用5注3），即延伸时间为4.5min，循环数设为5。

注494℃min

98℃sec

（Tm-5）℃sec

68℃min

4℃ Hold

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（２）用Dpn I对模板质粒DNA进行消化

① PCR反应结束后，在PCR反应液（总量50ul）中加入2ul Dpn I，轻轻混匀。 注）如果PCR是分成2份做的，每管各加1ul Dpn I。

② Spin down，37℃反应1小时。

注）可用PCR仪作温浴设备，很方便。

（备注）Dpn I反应结束后，可取5ul消化液进行琼脂糖凝胶电泳，以确认PCR产物。有时因为循环数较少（5个循环或更少），可能观察不到条带，即便如此，也可继续实验，多数情况下也能得到突变克隆。

（３）PCR产物自身环化

① 取出T4 Polynucleotide Kinase和Ligation high，冰浴融解。融解后，将Ligation

high轻轻搅拌均匀，spin down。

② 取一个新的PCR管，如下配制反应液：

Dpn I处理后PCR产物 2ul

灭菌蒸馏水 7ul

Ligation high

T4 Polynucleotide Kinase

Total Volume 5ul1ul15ul

③ 轻轻搅拌均匀，spin down。

④ 16℃反应1小时。

注）可用PCR仪作温浴设备，很方便。

⑤ 取部分反应液转化大肠杆菌。

（４）转化

建议使用商品化感受态细胞，具体操作方法请参考相应说明书。以下按东洋纺公司生产的感受态细胞为例说明。

① 取出感受态细胞（100ul），冰浴融解。

注）溶解后，如果分成小份进行实验，相应地减少各试剂用量。

② 取上述自身环化产物10ul，加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30min。 垂询电话：021-58794900

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注）建议用pBR322等载体同时转化另一管感受态细胞，作为阳性对照并测定转化效率。例如，感受态细胞的转化效率为1×10^9cfu/ug pBR322，1pg pBR322转化后，取100ul培养液突变，得到的菌落应为100个。

③ 42℃，30Sec热休克，冰浴放置2min。

④ 加入SOC培养基900ul，37℃振荡培养1小时。

⑤ 取适量涂布于适当的抗生素LB平板。

注）建议多涂几块平板，每块板10-200ul。

注）对于本试剂盒中的对照实验，可涂布氨苄青霉素和卡那霉素板，并加入IPTG/X-Gal。 ⑥ 37℃培养过夜（约16小时）

注）对于对照实验，如用1×10^9的感受态细胞转化，取100ul涂布时，可得到数百个菌落。如果操作恰当，蓝色菌落（突变体）应占80％以上。

（５）突变体的确认

挑取4-8个菌落，小抽质粒，用内切酶处理后电泳，根据酶切图片确认是否突变。然后对必要片段测序以确定序列。

当然也可以不通过酶切鉴定，直接用测序进行确认。

注）如果分成两份分别以不同循环进行PCR，建议挑取循环数较少所对应的菌落进行

鉴定。

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[６] 疑难解答 问题 原因

反向PCR扩增不佳

得不到克隆或克隆

数很少 目的片段扩增量少

感受态细胞转化率低 对策 进行预实验对引物和PCR条件进行确认和优化，以得到特异性条带。或凝胶回收PCR产物进行后续实验。 增加反向PCR的循环数。 感受态细胞的转化率至少需要10^8。

质粒DNA模板未甲基可用甲基化酶处理或转化甲基化菌株扩增模板质

克隆数太多（远远化。 粒。（参见[4]注意事项）

超出预计数量） LB培养板上抗生素失重新制备LB平板（抗生素平板在4℃下通常可保存

效或浓度不足 1个月）。

得不到目标突变体反向PCR扩增不佳（质进行预实验对引物和PCR条件进行确认和优化，（产生的质粒比原粒小很可能是引物错以得到特异性条带。或凝胶回收PCR产物进行后模板质粒小） 配造成） 续实验。

得不到目标突变体反向PCR扩增不佳

（产生的质粒没有

发生突变） 质粒DNA模板未甲基可用甲基化酶处理或转化甲基化菌株扩增模板质

化。 粒。（参见[4]注意事项）

确认LB板的IPTG/X-Gal是否有效，同时确认抗生IPTG/X-Gal浓度低 对照反应中，产生素是否有效。

的菌落都是白色或

使用的大肠杆菌菌株大多数是白色 换用DH5α，JM109等可进行蓝白筛选的菌株。 不能进行蓝白筛选 进行预实验对引物和PCR条件进行确认和优化，以得到特异性条带。或凝胶回收PCR产物进行后续实验。

[７] 参考资料

（１）相关培养基和试剂的组成

·LB培养基（1L）

10g蛋白胨、5g 酵母提取物、10g NaCl溶解后定容至1l，用NaOH溶液调节至pH7.2。 ·LB/Ap板

1l LB液体培养基中加入15g Agar，高压灭菌。待冷却至50℃左右时，加入氨苄青霉素至终浓度100ug/ml，摇匀铺板，凝固后待用。

·LB/Kan板

1l LB液体培养基中加入15g Agar，高压灭菌。待冷却至50℃左右时，加入卡那霉素至终 垂询电话：021-58794900

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浓度20ug/ml，摇匀铺板，凝固后待用。

·100mM IPTG（10ml）

0.24g IPTG用蒸馏水溶解，定容至10ml。过滤除菌，分装后-20℃保存。

·4% X-gal（10mL）

0.4g X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）用N,N-二甲基-甲酰胺（DMF）溶解，定容至10ml，分装。-20℃避光保存。

·LB/Ap（Kan）/IPTG/X-gal平板

取100mM IPTG和4％ X-gal各20ul涂布LB/Ap（Kan）板，干燥后待用。

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