东洋纺突变试剂盒说明书

东洋纺突变试剂盒说明书(中文)

08-03

KOD -Plus-

Mutagenesis Kit

(Code No. SMK-101)

使用说明书 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department

OSAKA JAPAN

东洋纺突变试剂盒说明书(中文)

目 录

[１] 简介.......................................................................................................................1

[２] 本试剂盒反向PCR突变的流程.............................................................................2

[３] 制品内容...............................................................................................................2

[３] 制品内容...............................................................................................................3

[４] 注意事项...............................................................................................................3

（１）模板用的质粒DNA..........................................................................................3

（２）PCR引物的设计和要求...................................................................................4

（３）PCR条件...........................................................................................................5

（４）PCR过程中的第二位点突变（目标突变以外的突变）...............................5

（５）对照质粒...........................................................................................................5

[５] 操作说明................................................................................................................7

（１）反向PCR...........................................................................................................7 （２）用DPN I对模板质粒DNA进行消化.................................................................8

（３）PCR产物自身环化...........................................................................................8

（４）转化...................................................................................................................8

（５）突变体的确认...................................................................................................9

[６] 疑难解答.............................................................................................................10

[７] 参考资料.............................................................................................................10

（１）相关培养基和试剂的组成.............................................................................10

（２）相关产品.........................................................................................................11

东洋纺突变试剂盒说明书(中文)

【 注意 】

本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。

在使用本产品时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。

NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE

Use of this product is covered by one or more of the following US patents and corresponding patent claims outside the US: 5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 and claims outside the US corresponding to US Patent No. 4,889,818. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser’s own internal research. No right under any other patent claim (such as the patented 5’ Nuclease Process claims in US Patents Nos. 5,210,015 and 5,487,972), no right to perform any patented method, and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

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[１] 简介

本产品采用高保真的KOD –Plus-酶，通过反向PCR法（Inverse PCR）进行定点突变。

反向PCR法是以环状DNA（如质粒）为模板，以反方向设计的两条引物对质粒进行完整的PCR。这样，通过引物设计导入突变或插入序列，或者在目标缺失序列两侧开始设计引物，从而在PCR产物上产生碱基突变或插入/删除序列，然后将PCR产物自身连接，转化后产生突变后的质粒。

本产品特征：

1. 突变域大

由于采用反向PCR法，不但可以实现几个碱基的替换、插入或缺失，还能进行几十个碱基的插入（Tag导入）和数百碱基的缺失。而且，也可以用任一种氨基酸替换特定部位的氨基酸进行饱和突变（Saturation Mutagenesis）

2. 突变的真实性

可以得到高达95％的突变体。而且，由于采用KOD –Plus-，并通过优化条件将PCR循环数降至最低，PCR过程中的第二位点突变（目标突变以外的突变）的可能性极小。对于10kb以上的质粒也可成功进行突变。

3. 操作简单*

使用本试剂盒不需使用磷酸化引物。PCR产物自身环化时，磷酸化反应和连接反应同时进行，包括转化在内一共只需简单的三个步骤。（图1）

*专利申请中

东洋纺突变试剂盒说明书(中文)

东洋纺（上海）生物科技有限公司

[２] 本试剂盒反向PCR突变的流程

图1．本试剂盒用反向PCR进行突变的流程

(A)质粒DNA模板进行甲基化，在引物上导入突变位点，进行反向PCR。

(B)利用Dpn I内切酶对甲基化的质粒DNA模板降解。

(C)T4 多聚磷酸激酶和连接酶同时对PCR产物磷酸化反应和连接，自身环化。

(D)最后PCR产物形成环状质粒，进行转化。 垂询电话：021-58794900

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[３] 制品内容

（-20℃保存）

名称 (20回用＊

)

KOD -Plus-（1U/μl） 25μl

10x Buffer for iPCR 125μl

2mM dNTPs 125μl

Dpn I(10U/μl) 50μl

T4 Polynucleotide Kinase(5U/μl） 50μl

Ligation high 250μl

Control Plasmid pAK119M (50ng/μl) 10μl