体细胞杂交技术在马铃薯遗传育种研究中的应用

体细胞杂交技术在马铃薯遗传育种研究中的应用———袁华玲，金黎平，谢开云，等 ３５７

2FGHI：Ｓ５３２，Ｓ３３０LMNOP：Ａ（２００５）０６－０３５７－０５LQRI：１６７２－３６３５

no

!"#$%&’()*+,-./012345

袁华玲，金黎平，谢开云，屈冬玉＊

（2789:;<=>?@01A，CD１０００８１）

‘a：体细胞杂交技术是打破有性杂交不亲和障碍，将野生种优良性状引入普通栽培种，丰富马铃薯遗传

基础，创造新种质的有效手段。本文在原生质体的分离融合、融合体的筛选、杂种的鉴定等方面对马铃薯体细胞杂交技术进行综述的基础上，介绍了近年来马铃薯体细胞杂交技术的研究进展，并就体细胞杂交技术在马铃薯遗传研究育种上的应用进行了阐述。

bcd：马铃薯；体细胞杂交；遗传育种

我国是马铃薯生产大国，近年来生产面积和产量逐年上升，但是生产上所用的马铃薯普通栽培种遗传基础比较狭窄，存在着抗病抗逆性差、品质性状有待于提高等问题［１］。在新品种选育过程中，用遗传基础狭窄的普通栽培种进行种内杂交，后代的遗传异质性差，优势不明显，难以选育出突破性的品种。此外在马铃薯普通栽培种中特别缺乏抗病和抗逆的基因，因此丰富育种材料的遗传基础，创造新种质资源是品种选育跨上新台阶的关键。

马铃薯的种质资源十分丰富，国际马铃薯中心收集的马铃薯种质有２３５个种，其中７４％为野生种和近缘种，在这些野生种和近缘种中存在着许多优良性状，如抗病虫性、抗逆性，优良品质等，将这些基因引入马铃薯普通栽培种中，丰富马铃薯普通栽培种中的遗传基础，创造新的种质用于马铃薯品种改良有着重要意义。但是马铃薯普通栽培种是同源四倍体植物，基因分离复杂，具有丰富遗传基础的野生种质资源大多数是二倍体，马铃薯普通栽培种与野生种杂交时存在着杂交不亲和性，难以成

TUVW：２００５－０７－２８

（１９６５－），女，博士研究生，研究方向：马XYZ[：袁华玲铃薯体细胞杂交。

“８６３”计划项目“马铃薯高效育种技术及\]^_：国家十五

优质高产多抗专用新品种选育”（２００４ＡＡ２４１１３０）资助；国家十五“８６３”重大专项“优质抗病马铃薯倍性技术育种与利用”（２００２ＡＡ２０７０１１）资助。

功，限制了野生种质资源中优良基因的利用。通过体细胞杂交可以打破有性杂交不亲和障碍，在近缘的种内或种间，甚至远缘的科属间产生体细胞杂种，扩大遗传变异范围。

１

１．１

马铃薯体细胞杂交技术的研究

efg!3Ghijk

体细胞杂交第一步是分离有活力的原生质体并

有效地再生出植株，在许多的已发表的报道中，引用较多的是Ｓｈｅｐａｒｄ等［２］，Ｂｉｎｄｉｎｇ等［３］，Ｈａｂｅｒｌａｃｈ等［４］报道的原生质体分离和培养条件。所用的原生质体起始培养基、愈伤组织形成培养基、以及诱导分化培养基都是ＭＳ、Ｂ５、ＫＭ、ＶＫＭ、Ｖ４７等基本培养基或略加修改，有研究表明，对外植体进行黑暗培养前处理有利于提高原生质体的产量，基因型的不同对原生质体的再生能力有影响［５］。

在已知的诱导原生质体融合的方法中，最经常使用的是聚二乙醇（ＰＥＧ）诱导和电融合。在马铃薯体细胞研究早期，较多采用ＰＥＧ化学诱导方法进行细胞融合，由于操作复杂，技术性要求较高，目前多采用电融合的方法。

１．２jk!3lm

原生质体融合目前还难以达到一对一特异性融

合，融合后的产物包括融合亲本以及同核体、异核体，有必要通过选择将所需要的异核体筛选出来。已知的很多选择体系在马铃薯异核体的选择上均有

＊通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｏｔａｔｏｖｉｆ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ

３５８

中国马铃薯，第１９卷，第６期，２００５

应用。对称杂交时大量选择异核体是根据亲本之一具有卡那霉素抗性［６］、链霉素抗性［７］，代谢类似物尿嘧啶抗性［８］以及杂种具有杂交种生长优势等特性［９］进行的。在进行体细胞不对称杂交时对原生质体进行辐射处理（γ、Ｘ射线或紫外线），或用碘乙酸处理（ＩＯＡ）可对融合形成的异核体进行筛选。适量的辐射处理（７０￣１０００Ｇｙ）导致细胞中染色体片断化阻止细胞分裂［１０，１１］，ＩＯＡ处理原生质体能够使胞质中的酶失活，抑制胞质生长。对一个亲本进行辐射处理，而另一个亲本用ＩＯＡ处理，只有异核体才能正常生长分裂，通过这种方法可将异核体筛选出来。

流式细胞仪具有单细胞快速筛选、ＤＮＡ定量分析的优点，可利用流式细胞仪进行体细胞杂种的筛选［１２］。但是流式细胞仪对总ＤＮＡ的检测幅度在

＋Ｓ．ｐｈｕｒｅｊａ体细胞杂交种植株的胞质组成进行分

析，发现８株具有Ｓ．ｐｈｕｒｅｊａ叶绿体ＤＮＡ，只有２株具有Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ叶绿体ＤＮＡ。

马铃薯的染色体很小，很难进行核型分析，用于其它作物体细胞杂种鉴定的核型分析方法在马铃薯的杂种鉴定上效果不佳，所以常用其他方法替代如分子标记ＡＦＬＰ、ＲＡＰＤ［５］。也可以用原位杂交ＧＩＳＨ的方法鉴定染色体片断是否在杂种细胞中存在［５］。

２体细胞杂交技术在马铃薯遗传改良中的应用

马铃薯体细胞杂交技术在马铃薯遗传改良中应

用，目的是将与马铃薯栽培种杂交不亲和的马铃薯野生种或近缘种的某些优良性状导入到栽培种中，这可以通过体细胞对称杂交和不对称杂交的方法而达到。此外，由于所有栽培种的马铃薯都是四倍体，马铃薯育种中一个重要的育种方法—分解育种法是在双单倍体水平上对种质进行改良，改良后的双单倍体种质需要合成具有两个双单倍体的优良特性，恢复原来的倍性水平，这可以通过体细胞对称杂交技术而达到。

８％左右变动，不能区分只丢失少量ＤＮＡ的不对称

杂种与真正的对称杂种，因此尽管流式细胞仪测定的ＤＮＡ总量与染色体数相关，但也只能进行杂种的初步筛选，为杂种的鉴定提供间接证据［１１］。

１．３!"#$%

在杂种的鉴定上，早期仅进行形态方面和细胞

染色体数的鉴定，杂种植株的形态基本呈现中间类型或结合了双亲的性状，染色体数的变异较大。后来同工酶谱分析也被用来鉴定体细胞杂种［１３，１４］。近年来随着生物技术的发展，分子标记技术和原位杂交技术被用于杂种的鉴定和精细分析。ＲＡＰＤ分子标记技术［１５￣１７］、ＳＳＲ分子标记技术［１２，１６］、ＲＦＬＰ分子标记技术［１６，１８，１９］以及ＡＦＬＰ技术等在杂种的鉴定上都有应用［１９］。亲缘关系较近的亲本融合体可用半随机ＰＣＲ引物特异地扩增外显子与内含子连接处结合ＤＮＡ序列来鉴定［２０］。也有利用亲本基因型对

２．１&’()*+

利用体细胞杂交技术克服马铃薯野生种和近缘

野生种与普通栽培种的生殖障碍，将野生种和近缘野生种的抗真菌、抗细菌、抗病毒的特性引入普通栽培种，提高栽培种的抗病性已有不少报道［１５，１６，１８，

２２，２６￣２８］

。在野生种Ｓ．ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ［２０］、Ｓ．ｐｉｎｎａｔｉｓｅｃ－

ｔｕｍ［２２］和Ｓ．ｃｉｒｃａｅｉｆｏｌｉｕｍ［２７］中存在的晚疫病抗性已通

过体细胞杂交技术转移到与栽培种融合的杂种中。通过体细胞杂交技术获得了Ｓ．ｓｔｅｎｏｔｏｍｕｍ＋Ｓ．

ＤＮａｓｅ１的敏感性不同来鉴定杂种的报道［２１］。

分子 …… 此处隐藏：2428字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……