区试DNA培训-赵久然

中国玉米标准DNA指纹库构建北京市农林科学院玉米研究中心 赵久然

一、国内玉米品种现状 推广情况 ≧5万亩品种 ≧100万亩品种 约300个 约60个

审定情况 已国审品种 约200个 已审定品种 1000多个 每年新审定品种数以百计 每年参加国家及省区试品种数以千计

保护情况 已获得品种权的品种 400多个 已申请品种权的品种 1000多个 自1999年，每年新申请保护品种数量逐年上升

二 国 内 玉 米 品 种 鉴 定 现 状

形态鉴定为主，同工酶 和蛋白电泳鉴定为辅

品种剧增

遗传基础狭窄

迫切需要开发新的鉴定技术

DNA指纹技术

RFLP

RAPD

SSR

SNP

AFLP

DNA指纹检测国家标准 DNA指纹检测试剂盒

标准DNA指纹库

三、国内玉米DUS测试情况

建立DUS测试中心 测试中心 测试分中心 1个 14个 49个 11个 约50个

编制玉米品种测试指南 测试 基本性状 选择性状 选用标准品种

四、分子标记应用于DUS 测试中的优势1. 多态性高，较少的标记就可满足特异性鉴定的需要 2. 测试周期短，不受季节的限制，任何时间都可进行测试， 可大大缩短品种权从申请到授权的时间间隔 3. 属中性变异，与形态性状无直接关系，因而不受育种者选 择倾向的影响 4. 可选择的标记数量多，完全可以适应品种数量不断增多的 要求 5. 不受环境的影响 6. 不必提供选育系谱 7. 不必针对自交系和杂交种制定不同的标准 8. 不必使用标准品种和对照品种5

五、承担玉米DNA指纹鉴定相关研究项目1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

分子标记技术在玉米新品种选育及种质鉴定中的应用研究(北京市重点、国家科 委重点及地方攻关，1995-1999) 应用分子标记选配强优势玉米杂交组合新方法研究(北京市科技新星,1995-1998) 玉米种子DNA指纹纯度及真伪鉴定技术应用推广(北京市农委,1999-2000) 华北农作物核心种质资源研究与利用(北京市科委重大,2001-2004) 应用分子标记技术进行玉米亲子鉴定研究(北京市科技新星,2001-2004) 玉米DNA指纹鉴定试剂盒的开发(北京市科技新星,2003-2005) 中国玉米新品种DNA指纹库构建研究(北京市科委重点,2003-2005) 玉米品种权保护中的分子标记技术研究(国家百千万人才，2005-2007) 超级玉米种质创新及中国玉米标准DNA指纹库构建(北京农业育种基础研究创新 平台，2005-2007) 玉米品种DNA指纹鉴定方法(农业部标准，2004-2005) 玉米品种纯度SSR检测方法(国家标准，2004-2005) 玉米品种资源收集及新品种选育(2005.1-2007.12,北京市科委重大) 玉米第六染色体抗病基因富集区域的功能基因组学研究(2006.1-2008.12,北京 市自然基金重大

) 基于毛细管电泳五色荧光系统的高通量玉米核心引物复合扩增体系的建立 (2007.1-2009.12, 青年骨干人才)

六、目前研究现状情况

1.通过各种标记方法比较 确定选用SSR标记

分子标记的类型

各种分子标记方法比较项目多态性程度 遗传特性 位点检测频率 DNA质量要求 DNA用量 同位素使用

RFLP中 共显性 1-2 高 多 是/ 否

RAPD中 显性 5-20 低 少 否

SSR高共显性 1 低 少 否

AFLP中 显性 30-100 高 多 是/ 否

带型统计难易

中

中

易

难

2.针对SSR标记存在问题 进行SSR技术体系优化

SSR技术体系优化从DNA提取、PCR扩增、电泳检测等环节对SSR技术进行了全面优 化，最终建立如下SSR标准实验体系 DNA提取:单粒种子及其它组织均研究出快速提取法

改良的玉米单粒种子DNA提取法 两步法高通量快速提取叶片

PCR扩增：由4h减少为2h 普通电泳检测：测序胶电泳，约需30-40min;快速银染法，由1.5h减少为约20min

毛细管电泳检测：96道毛细管电泳结合五色荧光检测系统。每检测96*10=960个样品，约需20min

DNA 提取

PCR扩增

S S R 标 准 操 作 流 程

电泳涂 板 灌 胶

银 染

结果分析

毛细管电泳及五色荧光检测- ABI3730XL

2006年 国家区试 玉米品种 真实性及 一致性检 测总结

五色荧光扫描结果

3.确定一套核心引物

DNA指纹分析方法的种类及发展 特征谱带法

仅在固定的材料范围内有效，效率很低 引物组合法 通过不同引物的有限组合，完全可以区分全部材 料，但不同研究者的数据不易整合 核心引物组合法

是引物组合法的扩展，不同实验室通过使用固定 的一套核心引物组合，其指纹图谱可以相互比较和 整合，为玉米DNA指纹图谱分析的标准化奠定基础