线粒体疾病的分子诊断

线粒体疾病的分子诊断Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders

线粒体(Mitochondrion)

1. 动物细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天 2. 每个细胞含几百到几千个线粒体 3. 每个线粒体含2-10 线粒体DNA(mtDNA)22

线粒体功能三羧酸循环 脂肪酸代谢 氧化磷酸化

ATP3

Mitochondrial Disease.Chest 20

其他功能 储存钙离子 调节膜电位并控制细胞程序性死亡 细胞增殖与细胞代谢的调控 合成胆固醇及某些血红素

——Wikipedia

Mitochondrial disorders

线粒体病

发现-

1962 年， Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢

率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年， Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA 突 变可引起人类疾病。

定义-

是遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，致使ATP合成障碍、能量来源不足

导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。

发病率- 约为1:5000(约每5000人中1人发病)Smeitink 2006

线粒体病 mitochondrial disorders—— 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病 16,569 bp circular double stranded (mtDNA)20%

线粒体蛋白(结构和功能)

1,500 nuclear genes 80%

——Shoubridge, 2001; Schapira,2000

structural protein of the OXPHOS complexes protein required for assembly of OXPHOS complexes proteins involved in mtDNA translation proteins involved in mtDNA maintenance proteins involved in mitochondrial fusion and fission

Douglas C. Wallace, 1817–1819

进一步导致线粒体功能异常：

①底物的运输缺陷；

②底物的利用缺陷；③柠檬酸循环异常； ④氧化磷酸化脱偶联；

⑤呼吸链异常。

发病特点

遗传异质性

核基因突变——常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传 (目前已鉴定的核基因突变约40种)

婴幼儿起病较常见 线粒体基因突变——母系遗传 (突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加 )mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同 的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。

核基因突变 编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹(PEO)、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征

线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位 16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活 性升高并乳酸亚基中毒症， 该女婴在出生后3天死亡。

线粒体基因突变一般特点 突变的影响： 引起呼吸链功能缺陷 氧化磷酸化酶异常

阈值效应：组

织特异性复制分离 母系遗传：不同突变后代发病风险不同。相比A8344G突变，携带 A3243G突变的母系后代更容易发病 。

突变分布：同质性——各器官组织分布相同 异质性——不同组织、细胞分布不同

同质性突变与异质性突变线粒体基因 同质性(Homoplasmy) 0 或 100% 异质性(Heteroplasmy) 0-100% 核基因 纯合子(Homozygous) 0 或 100% 杂合子(Heterozygous) 50%

线粒体基因突变点突变 目前已报道的mtDNA 点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因， 其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、DLoop区突变2种 LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎 红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等

重排 重排突变逾数百 遗传性痉挛性截瘫等

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线粒体疾病是复杂性疾病遗传方式复杂

常染色体隐性遗传(Autosomal Recessive) 常染色体显性遗传(Autosomal Dominant) 性连锁遗传(Sex linked) 母系遗传(Maternally inherited) 累及多系统(Multisystemic involvement) 影响几乎所有组织器官(Any organ or tissue can be affected)13

临床表型复杂

线粒体病的共同临床特点

婴儿期发病： 儿童发病：

(高度临床变异性 )

常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。

见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。

中枢神经系统损害：共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等

周围神经损害：交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征

视听神经损害：视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型 听力丧失出现在KSS

肌肉病见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO

Chinnery et al. Lancet 2000

线粒体疾病的生化诊断当一个患者的基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。

代谢产物分析(血液、尿液、脑脊液等)血液可以正常，但脑脊液多异常，(动脉比静脉好);乳酸/丙酮酸比高(>50:1) 提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒体疾病

酶测定 氧化磷酸化(OXPHOS)系统的酶活性测定。(western、比色法等)方法不稳定 一般情况下，血清CK正常或轻度升高；升高占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹 ；mtDNA丢失时非常高。

肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点： (1)出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或RRF为主要病理改变。 (2)上述病理改变出现的频率高。 (3)缺乏其他的肌肉病理改变。J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292

儿童及成人线粒体疾病的诊断标准主要诊断标准A

符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等； 多系统不明原因发病 必须至少三个系统出现临床症状

除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能 排除其它代谢和非代谢疾病

B 肌活检在骨骼肌中存在>2%破碎样红肌纤维

C 有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现： 50岁以下肌活检COX阴性肌纤维>2%; 50岁以上肌活检COX阴性肌纤维5%; 任一组织种呼吸链酶活性<20%;

任一细胞系中呼吸链酶活性<30%; 多于两组织内相同呼吸链酶活性<30%;

(Bernier et al, 2002)(3, 5)

次要诊断标准：A 症状符合线粒体脑肌病的临床表现；至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：

①30~50岁肌活检RRF在1%~2%;②30 岁以下肌活检出现RRF; ③电镜下见广泛线粒体异常；

B 至少一种呼吸链功能受抑制的表现：①生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%~30%; ②用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；

C 发现可能相关的mtDNA 异常； D 一种或多种氧化磷酸化受损的表现：①脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高； ②若疑为KSS,脑脊液蛋白质增高； ③PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低；

④最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。

(Bernier et al, 2002)(3, 5)

符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要 诊断指标的即为确诊线粒体病； 符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要 诊断指标的为拟诊线粒体病；

符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。

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