AFM的DNA样品制备技术研究

第25卷第1期2006年2月

电　子　显　微　学　报

Journal of Chinese E lectron Microscopy Society

V ol 225,N o 112006202

文章编号:100026281(2006)0120076204

AFM 的DNA 样品制备技术研究

蔡明辉

1,2

,赵　葵

1,3

,展　永2,倪嵋楠1,隋　丽1,孔福全1,杨明建

1,2

(1中国原子能科学研究院,北京102413;2河北工业大学理学院,天津300130;3北京师范大学射线束技术与材料改性教育部重点实验室,北京100875)

摘　要:AF M 应用中最为关键的一步无疑是样品的制备。本文介绍DNA 样品制备的几种主要方法,通过实验发展了两种适合对DNA 及其碎片进行长度测量和做统计分析的制样方法,它们分别采用APS -云母和纯云母为衬底。这两种方法不仅丰富了DNA 样品制备方法,对推广AF M 在生物研究中的应用也具有重要意义。关键词:原子力显微镜;质粒DNA ;样品制备;APS 2云母;云母中图分类号:Q523;Q336;TH74219;T N16　　文献标识码:A

　收稿日期:2005208229;修订日期:2005210224

　基金项目:国家自然科学基金资助项目(N o 110175095,N o 110435020,N o 110474018).

　Found ation item :National Natural Science Fundation of China (N o 110175095,N o 110435020,N o 110474018).　作者简介:蔡明辉(1980-),男(汉族),河北省唐山市人,硕士.

　　1982年,宾尼(Binnig )等人发明了扫描隧道显微镜(SPM ),它是一种可以从原子水平到纳米尺寸观察物质结构的三维成像工具,是一种新型的显微技术。1986年宾尼(Binnig )、魁特(Quate )和盖博(G erber )合作推出了原子力显微镜(atomic force

microscopy ,AFM )[1]

。AFM 在观测生物样品方面有

着独特的优势,例如:可以在近似生理环境下直接观测生物样品;在扫描样品过程中将针尖对样品的作用力控制在10-9

N ～10

-12

N ,使针尖对样品的损伤降

低到非常低的水平;AFM 样品制备突破了导电性的限制,与电子显微镜相比制样过程相对简单。因此,AFM 在生物研究中迅速得到了广泛应用。Pang [2]

和Boichot [3]

分别用AFM 观察了DNA 的双链断裂;Jiao

等[4]

用AFM 观察了肿瘤抑制蛋白P53与DNA 的相互作用;基因治疗中K awaura 等[5]

用AFM 观察受体介导DNA ;G uruing 等[6]

用AFM 研究多糖形成的凝胶网状结构;隋丽等

[7]

用AFM 观测重离子致DNA 损伤的研究;吕军鸿等[8]

用AFM 对DNA 单分子进

行定位切割与拾取。

在上述各类AFM 应用中,最为关键的一步无疑

是样品的制备,制样的好坏将决定整个实验的成败。现在国内外各个实验室的DNA 样品制备方法各种各样,无论是衬底的选择,还是DNA 样品的浓度,以及制样的细节等都各不相同。国内外应用比较广泛的主要有两大类DNA 制样方法:一是对云母表面进行修饰,所用的试剂有32氨丙基三乙氧基(APS ),戊二醛

[9]

,亚精胺

[10]

以及用阳离子进行预处理

[11]

等;

二是在DNA 水溶液中加入阳离子,参考文献

[12～17]都是采用的这种制样方法,但是各家所使

用的阳离子种类及浓度也各不相同。总之,从这些报道的DNA 样品制备方法中可以看出:每一种制备方法都有其各自的适用范围,为了满足对DNA 及其碎片进行长度测量并进行大量统计分析的要求

[7,18]

,必须找到一套适合我们自己研究的制样方

法。

本文将分别介绍以APS 2云母和纯云母为衬底的DNA 样品制备方法。

1　实验设备与材料

上海爱建纳米公司生产的A J 2Ⅲ型原子力显微镜,在室温下以T apping m ode 在空气中成像,相对湿度为33%～39%,所有图像采集的扫描速度为115H z ,像素为256×256;针尖选用俄罗斯MikroMasch 公司的型号为NSC11的硅针,共振频率

为315kH z ,力常数为48N Πm ;APS 2云母为中国科学院上海原子核研究所提供;PUC19DNA 购于大连宝生物工程有限公司,长度为2686bp ,含有70%以上的共价闭环。

2　实验方法

211　以APS 2云母为衬底的DNA 制样研究

APS 2云母为中国科学院上海原子核研究所赠

送,其制备步骤如下:制备4次蒸馏水

配制APS 溶液解理云母

自组装单层膜

钝化处理

其中钝化时间的长短直接影响APS 2云母的吸附力。

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通过大量实验摸索得到的DNA 样品制备流程如下。

①用4次蒸馏水将原始DNA 样品稀释至2ng Πμl ,且在涡旋震荡器上震荡1min 使样品在溶液中分散均匀;

②取5μl 的样品滴于APS 2云母上,并用封口膜覆盖在上面,沉积5min ;

③用4次蒸馏水冲洗约15次,每次水的体积在200μl 左右效果最好;

④放置在空气中约4h 以上后进行观测。图1是按照上述样品制备流程得到的AFM 图像。展示了APS 2云母上制样的三种情况。图1a 中DNA 分子的形态很正常但数量太少,不适合做统计

分析;图1c 中虽然DNA 分子数量很多,但是DNA 分子自身扭曲且分布不均匀,无法进行长度测量;图1b 中DNA 分子无论在形态还是数量上都合适,分散也比较均匀,适合进行长度测量和大量统计分析的研究,其中斜线为电子学噪声,并不影响观测。相同的制样流程却出现以上三种不同的现象,根本原因在于APS 2云母的吸附力强弱存在很大差别。为了满足不同的实验目的,需要吸附力强弱不同的APS 2云母。例如,图1a 所示的APS 2云母适合单分子

的操纵,而图1c 所示的APS 2云母则适合做强吸附的实验,只有图1b 所示的APS 2云母适合我们的实验。但是,APS 2云母吸附力的强弱又很难把握,为我们的研究带来巨大的困难,同时也迫使我们去探索另外一种新的制样方式2纯云母上的DNA 样品制备。图1　质粒DNA 在APS 2云母上的图像。扫描范围:6μm ×6μm Fig.1　Images of plasmid DNA deposited on APS 2mica.Scan size :6μm ×6μm

212　在纯云母上的DNA 制样研究

采取分三步走的研究思路:首先,把DNA 浓度固定调节Mg 2+

浓度并找到最佳值;其次,固定Mg 2+

浓度调节DNA 浓度找到最佳值;最后,调节吸附时

间以及冲洗次数等细节问题,完善制样流程。

21211　Mg 2+

浓度的确定

首先,根据在APS 2云母上的经验,把DNA 浓度

固定在1ng Πμl ,然后调节Mg 2+

浓度来筛选最合适的

浓度值。图2是在不同的Mg 2+

浓度下得到的AFM 图像。

图2a 中DNA 分子发生凝聚现象,说明Mg 2+

浓度太大,以至于DNA 分子相互结合在一起不能均匀地分散在云母上;图2b 中DNA 分子则相互交联形

成DNA 的网格结构,对于这种现象Aiguo [14]

和

Malinovskis 等[19]

也进行了相关研究;图2c 中DNA 分

子之间交联随着Mg 2+

浓度的减小已经消失,但是DNA 分子自身的扭曲还存在;图2d 中可以看到DNA 分子正常的超螺旋形态,但由于冲洗过程水流

的影响使DNA 分子有明显分子取向,还需要进一步改善。21212　DNA 浓度的确定把Mg 2+

浓度固定在1mm ol ΠL ,然后调节DNA 浓度,筛选最合适的浓度值。图3是在不同的

DNA 浓度下得到的AFM 图像。

从图3中的3张图像可以看到,图3a 中DNA 的数量太少,对于要做大量统计的实验不利;而图3c 中DNA 又太多以至于不同分子之间有重 …… 此处隐藏：7149字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……