基因工程实验报告(终)华南理工大学

分子生物学实验报告

(2011 -2012 学年第一学期)

实验内容：基因工程综合实验

实验时间：2012.10.28-2012.11.2

提交日期： 2012 年 11 月 5 日

实验目的

大肠杆菌表达包涵体蛋白的基因工程实验以一个目的基因片段的获得，表达和纯化和活性分析为主线，抓住蛋白和核酸两大主题，建立一个综合型和研究性的大实验教学体系，重视各项技术的衔接。综合性实验旨在启迪严谨的科学思维和创新意识，提高对实验方法和实验技术的综合运用能力。具体到每个实验的实验目的如下：

1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。

2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。

3. 掌握分光光度法估算样品中DNA的浓度和纯度。

4. 熟悉紫外分光光度计的使用方法。

5．学习掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法及其运用。

6.掌握用CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA

7.了解基因组DNA的其它提取方法

8.了解酶切原理。

9.掌握酶切体系的建立原则。

10. 熟悉基因工程所用限制性内切酶的特点。

11.学习掌握外源DNA与质粒载体的重组连接技术

12.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法及技术。

13.熟练掌握用重组DNA转化感受态细胞的技术，为基因克隆打好基础

14.学习掌握PCR技术的原理及基本操作

15.学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。

16.掌握蛋白质的SDS-PAGE电泳原理和操作技术及应用。

实验流程

双酶切

PCR

DNA琼脂糖电泳

PCR产物回收

抗性菌的筛选

质粒的提取

Southern杂交

pcr

蛋白质的提取分离 SDS-GAGE蛋白质检测

具体每日实验流程

1、 10月28日，利用双酶切，DNA琼脂糖凝胶电泳，胶回收，双酶切目的基因和载体连接过夜。

2、10月29日下午，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化，涂平板和培养，先正放置半小时，再倒置培养过夜。

3、10月30日下午，挑阳性（含抗性基因）菌落，菌落PCR，转板和液体培养菌体。

4、10月31日上午，转接培养，诱导表达，晚上，离心菌体，去上清，冰箱放置保存。

5、11月1日下午，离心菌体，提质粒，跑电泳进行鉴定，培养菌体。

6、11月2日下午，跑SDS蛋白质电泳 。

本次实验是多个基因工程基础实验内容的有机整合，交叉进行。从一个基因片段的获得，鉴定，表达和纯化和活性分析为主线，将核酸提取，PCR，RT-PCR，核酸杂交，表达和Western杂交等基因工程实验技术有机整合。

目的基因的扩增：（1）染色体DNA的提取，（2）PCR的引物设计与扩增反应，（3）电泳鉴定；

载体质粒的制备：（1）质粒DNA的提取、纯化，（2）DNA纯度、浓度与分子量的测定，电泳法、紫外线吸收法鉴定；

目的基因与载体的连接（1）目的基因和质粒DNA的限制性内切酶的酶切反应，（2）载体与目的基因的连接反应：

重组DNA导入宿主细胞：（1）感受态宿主细胞的制备，（2）重组质粒DNA的转化，（3）重组子的选择（抗性基因）以及重组质粒的提取、酶切与电泳鉴定。

Southern杂交（1）染色体DNA的酶切与电泳鉴定（2）DNA的转移，（3）探针DNA的标记（4）杂交和显色。

表达蛋白的工程菌的构建：（1）重组表达质粒的构建，（2）目的基因的诱导表达，（3）表达产物的SDS-PAGE鉴定

Western杂交（1）蛋白质的电泳鉴定（2）蛋白质的的转移，（3）杂交和显色

工程菌发酵培养的优化与表达产物的分离、纯化：（1）发酵条件的优化选择，（2）收集菌体、超声波破碎、分级沉淀，（3）凝胶层析分离、纯化表达产物，SDS-PAGE鉴定表达产物的纯度。

PCR目的基因

反应体系：水 31.75

模板菌液 15

10*buffer 5

dNTP 4

引物1 2

引物2 2

酶 0.25

反应条件：94℃预变性5min，

94℃预变性30s

55℃复性30s，

72℃延伸1min，

72℃充分延伸7min

4℃ 2h

30circle

结果与分析：PCR是根据DNA双螺旋结构和其半保留复制的性质产生的：

94℃下变性，AT、GC之间的氢键断裂，目的基因的双螺旋DNA解链成两条单链。

55℃下复性，3’和5’端的引物通过碱基互补配对，结合到单链DNA上。

72℃下延伸，Taq酶在72℃下活性最高，它结合到引物末端，开始利用dNTP合成双链DNA。

因此PCR之后，模板DNA扩增了2^n（循环数）倍，我们得到的是大量扩增的目的基因。

注意：1变性温度一般为94~95度，改变得比较少

2 复性温度失根据模板DNA的序列而定的，可以通过改变复性温度，提高PCR的准确度。复性温度一般用GC含量估算，但最准确是要用模板的dG（自由能）来算出。

3 延伸温度是由所用酶的最适温度决定的，Taq酶为72度。 4 最后一个循环，72度延伸时间要足够长，使DNA充分延伸。

双酶切目的基因与纯化

体系：Nsp V 1ul

Xho I 1ul

M buffer（10×） 5ul

质粒DNA 10ul （200ng/ul）

蒸馏水 33ul

反应条件：37℃,2-3h

结果与分析：

ATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGAAGGAGTTCGAACCATGGCTCGCTTCGCTCTGACTGTTGTCCGGCATGGAGAAACAAGATTTAACAAGGAGAAAATAATCCAAGGACAAGGAGTAGATGAACCTCTTTCAGAAACTGGATTTAAACAAGCAGCAGCTGCTGGTATATTTCTGAATAATGTGAAGTTTACTCATGCTTTCTCCAGTGATCTCATGAGGACAAAGCAGACCATGCATGGAATTTTGGAGAGAAGCAAATTTTGCAAAGATATGACGGTAAAGTATGACTCAAGACTTCGGGAAAGGAAATACGGGGTTGTAGAAGGCAAAGCGCTAAGTGAGCTGAGGGCC

ATGGCCAAAGCAGCCAGGGAAGAGTGCCCTGTGTTTACACCGCCCGGAGGAGAGACGCTGGACCAGGTGAAAATGCGTGGAATAGACTTTTTTGAATTTCTTTGTCAACTAATCCTGAAAGAAGCGGATCAAAAAGAACAGTTTTCCCAAGGATCTCCAAGCAACTGTCTGGAAACTTCTTTGGCAGAGATATTTCCTTTAGGAAAAAATCACAGCTCTAAAGTTAATTCAGACAGCGGTATTCCAGGATTAGCAGCCAGTGTCTTAGTTGTGAGTCACGGTGCTTACATGAGAAGTCTGTTTGATTATTTTCTGACTGACCTTAAGTGTTCCTTACCAGCCACTCTGAGCAGATCTGAACTTATGTCAGTCACTCCCAATACAGGGATGAGTCTCTTTATCATAAACTTTGAGGAAGGAAGAGAAGTTAAACCAACGGTTCAGTGTATTTGTATGAACCTACAGGATCATCTAAATGGACTGACTGAAACTCGCTAGCTCGAG

两种内切酶：Nsp V，Xho I

以上为目的基因的碱基序列，其中黑体处TCGAA是Nsp V识别的序列，CTCGAG是Xho I识别的序列。

酶切之后，我们得到了带有粘性末端的目的基因，可以与载体进行连接，组成重组质粒，倒入大肠杆菌。

双酶切的优势：双酶切可以防止连接步骤的载体自连，也可以增加目的基因与载体连接成功的几率，也就是能增加连接后，重组载体的数量（浓度），保证转化成功。

琼脂糖电泳

原理：琼脂糖凝胶中，有一定孔径的多孔通道。DNA分子由于带有磷酸基团，因此在电场的作用下依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶）和缓冲液（TAE），在电场中能以一定的迁移率从负极移向正极。凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。对于线性DNA，小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2 …… 此处隐藏：6370字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……