高效液相色谱_荧光法测定小鼠脑组织中的单胺类神经递质

772 安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Dec;44(6)

高效液相色谱-荧光法测定小鼠脑组织中的单胺类神经递质

金忠秀,许媛媛,李　平,储成顶

摘要　目的　建立同时检测小鼠脑内的去甲肾上腺素

(NE)、多巴胺(DA)、52羟色胺(52HT)3种神经递质的高效

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2

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方法简单、省时,梯度洗脱样品的洗脱时间得到明显

缩短。1　材料与方法

1.1　仪器和试剂　WatersHPLC:2475荧光检测

液相色谱方法。方法　采用的色谱条件为:C18柱分离,梯度洗脱。结果　方法的检测限(以3倍信噪比计算)215μg/

L以下,回收率均在8718%～10517%之间,样品日内测定峰

面积的相对标准偏差在314%以下。结论　该方法具有检测灵敏度高、样品制备简便等优点,对小鼠脑内的3种单胺类递质的检测具有实用价值。

主题词　生物源单胺类;脑;色谱法,高效液相;荧光光度测定法

中图分类号　R329.54;R971

文献标识码A文章编号1000-1492(2009)06-0772-器,Waters600E高压泵,Rheodyne7725进样阀。Sigma冷冻离心机。DA、52和NE均为Sigma公

司产品;甲醇为国产HP,高氯酸、盐酸和固定相分析柱为C18反相色谱柱×416mm),流动相组成A为甲醇,B为2010mmol/l柠檬酸三钠缓冲液(用盐酸调节pH为510mmol/L,经0145μm的滤膜过滤)。梯度程序

　　血、镇痛、,理意义。,(NE)和多巴胺(DA),后

[1]

者主要指52羟色胺(52HT)。测定脑组织中单胺

见表1。在线氦气脱气,流速为110ml/min,柱温保持在35℃,荧光检测器波长设置为:激发波长280nm,发射波长315nm;以峰面积定量。

表1　梯度洗脱程序

时间(min)

0.07.09.014.015.0205

A(%)551010595

B(%)95959090955

类神经递质,最常用的方法是高效液相色谱电化学

[2-3]

检测法(HPLC2ECD)和离子对或者荧光衍生反相色谱荧光检测法

[4-7]

。HPLC2ECD的优点是灵敏

度较高,但是ECD对流动相变化较为敏感,故较少采用梯度洗脱,另外电化学检测器的工作电极容易污染,需要经常拆下来清洗。采用离子对反相色谱自然荧光检测法测定了大鼠脑组织分区的DA、52HT和NE

[4]

,但是离子对试剂与柱填料结合后,难

[5-7]

以洗去,影响柱寿命。文献报道建立起了荧光

1.3　标准品和脑匀浆样品的制备与测定　标准品

衍生化方法测定单胺类神经递质,这些方法需要特殊试剂进行衍生化反应,而且操作较为复杂,因此,其应用受到了限制。　　本研究采用高效液相色谱-荧光检测法,采用C18柱分离,尝试设置梯度非离子对洗脱,同时检测

分别用210%的高氯酸配成浓度为1g/L的标准储备液,贮存于-20℃冰箱内,分析时按需要用210%高氯酸稀释成各种浓度的标准液。测定标准曲线,

NE、DA、52HT在110～100010μg/L之间设定8个浓度系列,取2010μl进样,以峰面积对浓度绘制标准曲线,确定线性范围。脑匀浆样品的制备:小鼠直接断头,在冰台上剥离出小鼠全脑(保留大脑及间脑),称重。按0110g脑(湿重)加入110ml210%高氯酸比例加入高氯酸,放入210ml的玻璃匀浆管内,冰浴下匀浆。将匀浆液收集于115ml离心管中,于114×10r/min下低温离心20min,取上清液0122μm的滤器过滤进样检测。以保留时间定性,外标法定量。

4

了NE、DA和52HT。样品不需经复杂的纯化过程,

2009-07-26接收

基金项目:安徽医科大学校科研基金资助项目(编号:2007kj24)作者单位:安徽医科大学公共卫生学院,合肥　230032

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安徽医科大学附属省立医院脑外科,合肥　230001

作者简介:金忠秀,女,讲师;

储成顶,男,高级实验师,责任作者,E2mail:zxj20029802@

http://www.77cn.com.cn

安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Dec;44(6) 773

1.4　统计学处理　数据结果以x ±s表示,采用线

别为:NE210μg/L、DA215μg/L、52HT115μg/L。

表2　NE、DA和52HT的线性回归方程、线性范围、相关系数单胺类递质

NEDA52HT

性回归最小二乘法计算单胺类神经递质的标准曲线。2　结果

2.1　标准色谱图　实验得到各标准物质谱图见图1,3种标准物质都达到了基线分离。得到了小鼠脑组织匀浆样品的色谱图(图2),除了多巴胺前有一

线性范围(μg/L)

y=2671000x10.0～1000.0y=2237320x10.0～1000.0y=3629140x5.0～500.0回归方程

相关系数

0.99970.99990.9989

大的未知峰与多巴胺未达到基线分离外,其余各种

化合物均达到基线分离。标准液和脑匀浆样品中的NE、DA和52HT的峰之间分离较好(样品中DA与杂质峰的分离尚有待改善)

。

2.3　回收率和精密度的测定　按113操作,按0110g脑(湿重)加入110ml的比例加入低、中、高

浓度的标准溶液,于同日内分别测定NE、DA和52HT加入量的对照品脑组织匀浆样品,每种加入量样品平行测定5次,计算各种标准物不同浓度的脑组织匀浆样品回收率,。连续测定混合标准液5次,NE、21和314%。

　(n=5,%,x ±s)加入量(μg/L)

25.0100.0500.0

NE90.0±2.693.4±2.395.5±1.9

DA105.7±2.4103.1±2.099.5±1.7

52HT99.8±3.295.8±1.387.8±2.8

2.4　样品测定　用上述方法,对10只小鼠脑组织

图1　3种神经递质混合标准溶液色谱图　　(1:NE;2:DA;3:52HT

)

中NE、DA、52HT的浓度含量进行了测定,其测定值转化为相对应的脑组织克数含量(测定的浓度值×加入210%高氯酸的体积/小鼠脑组织湿重),得到单胺类神经递质的含量分别为NE(5179±0159)μg/g、DA(2106±0130)μg/g、52HT(0150±0107)μg/g。3　讨论

3.1　高氯酸及其浓度的选择　分别用110%HClO4、110%HCl作为稀释液稀释标准品进样,观

图2　脑匀浆样品色谱图(1:NE;2:DA;3:52HT)

2.2　线性范围和检测限　采用外标法,以不同浓度

的标准液进样测定,以峰面积y为纵坐标、进样浓度

x(μg/L)为横坐标作图,计算出线性回归方程(表2)。以3倍信噪比计算得到方法的最低检测限分

测空白色谱图,1%HCl稀释标准,色谱峰干扰最小,但标准物易于降解,高氯酸虽干扰大一些,但有助于标准物的稳定,因此,本实验研究确定标准溶液稀释液为HClO4。分析样品实验发现多巴胺前有一较大基体未知峰,当研究HClO4浓度为110%、210%、310%、410%对基体峰的影响时,发现用210%的HClO4处理样品所得谱图的未知基体峰峰值明显低于用1%的HClO4处理样品所得峰值;随着HClO4浓度增大,峰值变化不大。为保护色谱柱采用210%的HClO4。

报道流动相

的pH在315～510之间为较好的分析条件,但是pH3.2　流动相缓冲溶液pH值　文献

[8]

774 ◇调查与分析◇

安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2009Dec;44(6)

急性白血病1185例次住院患者血流感染特点及危险因素分析

秦　慧,杨明珍,宋万灯,武琳琳,缪华伟,程　歆,吴　炜,刘沁华,王永庆

摘要　目的　分析急性白血病(AL)并发血流感染的临床特征、危险因素及病原菌株特点。方法　对1185例次AL住院患者进行回顾性研究,统计分析其发生血流感染的临床特点及危险因素。结果　AL合并血流感染的发生率为

5106%,病死率为0168%。老年组(≥60岁)和非老年组(<60岁)血流感染发生率分 …… 此处隐藏：4158字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……