表达抗流感病毒基因重组慢病毒滴度测定及感染效率分析

（）：动物医学进展，２０１２，３３６１５－

ｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｅｄｉｃｉｎｅＰｒｏｒｅｓｓ　　ｇｙＭ

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檲檲檲檲殘研究论文

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表达抗流感病毒基因重组慢病毒滴度测定及感染效率分析

胡卫杰，刘晓敏

（）中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家实验室，黑龙江哈尔滨１５０００１

分别将靶向禽流感病毒（多靶点ｓ采用ＡＩＶ）ｉＲＮＡ和鸡Ｍｘ基因克隆到ｐ２０１慢病毒表达载体，　　摘　要：

鸡βａｃｔｉｎ启动子替换ｐ２０１慢病毒载体ＣＭＶ启动子构建重组慢病毒载体ｐ２０１ｘｓｉＲＮＡ。并将其与辅－－－Ｍ－β

实时荧光定量Ｐ助包装质粒共转染２９３Ｔ细胞，７２ｈ后收集细胞上清，ＣＲ测定重组慢病毒（ｒＬＶ－ＭＸｓｉＲ－－与对照组重组慢病毒（两者比较确定ｒＮＡ）ｒＬＶ－ＧＦＰ）ＣＴ值，ＬＶ－ＭＸｓｉＲＮＡ滴度。ｒＬＶ－ＭｘｓｉＲＮＡ以－－

并传代培养，提取后代细胞ＲＭＯＩ＝４感染猪胎儿成纤维细胞（ＰＥＦ）ＮＡ检测外源基因转录以及应用间接免疫荧光试验检测鸡Ｍｘ蛋白的表达。结果表明，ｒＬＶ－ＭｘｓｉＲＮＡ浓缩后滴度与已知滴度的ｒＬＶ－ＧＦＰ相等，－

８　

／为２×１感染Ｐ０ＴＵｍＬ，ＥＦ效率＞９５％。感染ｒＬＶ－ＭｘｓｉＲＮＡ的细胞传至第５代和第１０代检测到外源－基因转录以及鸡Ｍｘ蛋白的表达。表达鸡Ｍｘ基因和靶向ＡＩＶ多靶点ｓｉＲＮＡ重组慢病毒滴度的测定与感其结果为研究抗Ａ染效率的分析，ＩＶ转基因猪及其抗ＡＩＶ的体外评价奠定了基础。；慢病毒；鸡Ｍ小干扰Ｒ猪胎儿成纤维细胞ａｃｔｉｎｘ基因；ＮＡ；　　关键词：－β

中图分类号：Ｓ８５２．６５１

文献标识码：Ａ

（）文章编号：１００７５０３８２０１２０６０００１０５－－－

人流感病毒的宿主和不同来源　　猪被认为是禽、

，混合器”采取有效措施阻断禽流流感病毒的基因“

，感病毒（在猪体内的复ＡｖａｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡＩＶ）　　制可能会抑制Ａ人流感病毒在猪ＩＶ与猪流感病毒、体内相互杂交产生新的变异株，对公共卫生具有深

１］

。远意义［

［］

高分子量ＧＴＰ酶的发动蛋白超家族的成员２。研

究表明不同动物的Ｍｘ蛋白能够特异性抑制不同病毒的复制，在人和小鼠已证明有抗多种病毒复制特

３］

。小干扰Ｒ性［ＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎＲＮＡ，ｓｉＲ　－ｇ　

是近年来发现的一类２ＮＡ）１ｎｔ～２３ｎｔ短序列由ＤＲＮＡ，ｉｃｅｒ加工长双链ＲＮＡ而成

［４］

与ｍＲ引起靶ｍＲＮＡ特异性的碱基互补配对，ＮＡ的降解或者抑制其翻译，在基因调控中扮演重要的角色。ｓ生物发生ｉＲＮＡ和ｍｉｃｒｏＲＮＡ在分子特征、

５］

，和效应子作用是相似［属于转录后水平的基因沉

默机制。

慢病毒可以介导外源基因整合到分裂期及非分转基因效率高，且遗传稳定，因裂期细胞染色体上，

２０１２０２１３　收稿日期：－－

“）；）十一五”国家科技支撑计划项目（国家重点实验室基金项目（２００８ＢＡＤＢ２Ｂ０１ＮＫＬＶＢＰ２００８２９　基金项目：：（），，，，。作者简介胡卫杰男四川眉山人硕士研究生主要从事病原微生物研究１９８５－　

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而慢病毒载体在基因治疗、基因沉默、转基因动物研

６］

。究领域得到了有效利用［

本研究以慢病毒Ｐ构建以鸡β２０１载体为骨架，－

表达抗Ａａｃｔｉｎ启动子，ＩＶ复制的鸡Ｍｘ基因和靶向

包装的重ＡＩＶ多靶点ｓｉＲＮＡ重组慢病毒表达载体；组慢病毒可以高效感染猪胎儿成纤维细胞（ｏｒｃｉｎｅｐ，，并通过ＰｅｍｂｒｏｎａｔｅｄｆｉｂｒａｂｌａｓｔＰＥＦ）ＣＲ、ＲＴ　－ｙＰＣＲ以及间接免疫荧光试验能够在不同代次细胞

中检测到外源基因的整合和高效表达。

Ｍｘ蛋白是由干扰素诱导的具有３个结构域的

１　材料与方法

１．１　材料

质粒和细胞　慢病毒包装辅助质粒１．１．１　病毒、

（／ＶｉｒａｌＰｏｗｅｒＴＭＰａｃｋｉｎＭｉｘＶＳＬＰ１、ＬＰ２、ＬＰ－ｇｐｐｐ　和包装细胞系２购自ＩＶＧ）９３ＦＴ组成，ｎｖｉｔｒｏｅｎ公ｇ／司；ｃＤＮＡＴＭ　６．２ＥｍＧＦＰ－ＮＰＰＡ－ＰＢ２和－ＧＷ－ｐ／慢２ＥｍＧＦＰ－Ｍｘ由本研究室构建；ｃＤＮＡＴＭ６．－ＧＷｐ

病毒表达载体ｐ２０１和含鸡βａｃｔｉｎ启动子质粒－

猪胎儿成纤维细ＣＡＧＧＳＦＬＰｅ由本研究室保存；－ｐ

胞由东北农业大学刘忠华教授馈赠；表达ＧＦＰ慢病毒（由本研究室制备。ＬＶ－ＧＦＰ）

，能够通过

２动物医学进展　２总第２０１２年　第３３卷　第６期（２８期）

１．１．２　酶及其他试剂　ＳＹＢＲＧＲＥＥＮｒｅａｌｔｉｍｅ　　－

ＴＭ

、限制性内切酶、ＰＣＲＫｉｔＴａｄＮＴＰ、ＤＮＡ　ｑ酶、大ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００和ＤＬ１００００为宝生物工程（　　　　　

连）有限公司产品；质粒去内毒素大提试剂盒为ＱＩＡＧＥＮ公司产品；ＲＮＡ提取试剂盒均为上海华

脂质体２舜生物技术有限公司产品；０００为Ｉｎｖｉｔｒｏ　－兔抗鸡Ｍｅｎ公司产品；ｘ蛋白多抗由本室制备；ｇ

为北京中杉金ＦＩＴＣ标记的羊抗兔ＩＧ（ＦＩＴＣＩＧ）－ｇｇ

桥生物有限公司产品。

１．１．３　引物设计　应用Ｏｌｉｏ６．０软件根据本实验　ｇ室克隆的鸡Ｍｘ基因和构建的多靶点ｓｉＲＮＡ设计扩增引物以及ｇａｇ基因包装信号检测引物和内参基引物由上海生工生物工程技术因βａｃｔｉｎ检测引物，－

）。服务有限公司合成（表１

表１　引物

Ｔａｂｌｅ１　Ｔｈｅｒｉｍｅｒｓ　　ｐ

引物名称

Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ　Ｍｘｆｏｒｗａｒｄ－Ｍｘｒｅｖｅｒｓｅ－ｓｉＲＮＡｆｏｒｗａｒｄ－ｒｅｖｅｒｓｅｓｉＲＮＡ－ａｆｏｒｗａｒｄ－ｇｇａｒｅｖｅｒｓｅ－ｇｇａｃｔｉｎｆｏｒｗａｒｄ－－β

ａｃｔｉｎｒｅｖｅｒｓｅ－－β

）引物序列（５′′～３

Ｐｒｉｍｅｒｓｅｕｅｎｃｅｓ　ｑ

ＡＡＴＧＡＡＣＡＡＴＣＣＡＴＧＧＴＣＣＡ（ＮｈｅⅠ）ＴＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＡＡＡＧＴＣＴ（ＮｏｔⅠ）ＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＣＣＴＴＣＴＡ（ＸｈｏⅠ）ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＡＡＴＴＧＣＴＴ（ＥｃｏＲⅠ）ＧＧＡＧＣＴＡＧＡＡＣＧＡＴＴＣＧＣＡＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣ

片段长度／ｂｐ

Ｌｅｎｔｈｇ２１１８　　

退火温度／℃

Ａｎｎｅａｌｉｎｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｇｐ　

５８

２７２　５８．１

８２　５５

３９２　５５

１．２　方法

１．２．１　ｐ２０１ｘｓｉＲＮＡ载体的构建　以ｐｃＤ－－Ｍ－－β

／ＮＡＴＭ６．２ＥｍＧＦＰ－ＮＰＰＡ－ＰＢ２为模板扩增－ＧＷ－多靶点ｓ产物用Ｘ定ｉＲＮＡ，ｈｏⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切，向插入慢病毒载体ｐ得到重组的慢病毒中间载２０１，／体ｐ以ｐ２０１ｃＤＮＡＴＭ６．ｓｉＲＮＡ；２ＥｍＧＦＰ－Ｍｘ …… 此处隐藏：7453字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……