分子生物学研究的主要方法10版

这 是 真 的 吗？

分子生物学研究主要方法 Molecular and cloning technology 聚合酶链反应PCR DNA电泳 基因转移 核酸杂交

聚合酶链反应PCR

Kary B Mullis

Michael Smith

PCR

用检测目标基因 A以一股DNA单链为模板，在引物(primer) 的存在下，DNA多聚酶沿模板以5′→3方 向延伸引物的过程。

(1〉变性：加热使靶DNA欢链解离成两条单链。

(2)引物与靶DNA退火：降低温度至遥当水平，促使两个引物根据碱基互补的原理分别结 合至靶DNA两条链的3‘末端。 (3)引物延伸：在DNA合酶催化下，引物沿 着靶3‘末端向5’末端延伸

经25~30次循环后，实际值一般为105~107。 2.水生嗜热菌，称Toq DNA多聚酶，如下特点： 1)热稳定性：95℃。

2)高特异性：最适温度为70~75℃,因此，允许引物与模板在55~60℃退火，在72℃延伸。 3)适宜较长DNA片段的扩增

(1)引物：引物一般通过化学合成获得，长 度为15~30碱基为宜；

(2)底物浓度：四种脱氧三磷单核苷酸 dCTP、dATP、dGTP和dTTP的总称。dATP、 dCTP、dGTP和dTTP浓度应相同。 (3)温度：变性温度，一般为94℃左右， 20~30秒；复性温度，一般为55~60℃,30 秒；延伸温度，一般为72℃左右。 (4)循环次数：25~30个循环。

VideoPCR

More Cycles = More DNASize Number of cycles Marker 0 10 15 20 25 30

DNA

分离 提纯

测序

探针

克隆

琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，当琼脂糖加热至90℃左右，即可形成清亮、透明的液体。 浇在模板上冷却后固化形成凝胶。其凝固点为

40~45℃。通过琼脂糖凝胶电泳可识别分子量相差100碱基对(bp)的DNA片段。

DNA琼脂糖凝胶电泳

DNA电泳可分离不同分子量的DNA

DNA琼脂糖凝胶电泳 各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷 的离子，在电场中向相反电极移动。

利用这一原理可以通过电泳将不同分子量的DNA分离，通过荧光染料染色鉴定各DNA片段的分子量； 从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。