用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱

()()用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱

钟筱波　PaulF.Fransz　J.HansdeJong　PimZabel

(荷兰瓦赫宁根农业大学分子生物学系)

HighResolutionPhysicalinsitu　Fransz　J.HansdeJongand　PimZabel

(ofBiology,WageningenAgriculturalUniversity,TheNetherlands)

DNA序列在染色体上的定位和分子图谱(molecularmap)的构建是克隆目的基因的基础。用常规分子生物学技术构建分子图谱是基于对DNA分子标记(molecularmarker),如RFLP、RAPD、ALFP等的遗传分析,从中找出不同DNA序列之间的连锁遗传关系和相关位置。这种分析方法的准确性和图谱的分辨率(resolution)水平将取决于染色体减数分裂时DNA的重组率(meioticrecombination)。但由于重组率在染色体上的分布是不均匀的,Sherman和Stack(1995)发现靠近着丝点(centromere)的异染色质(heterochromatin)区的DNA重组率要比远离着丝点的同染色质(euchromatin)区低很多。这样就会造成两个分子标记之间的遗传距离(geneticdistance)由于在染色体上的位置不同而与真实的物理距离(physicaldistance)发生偏差。因此,人们需要一些更准确的技术来弥补这种偏差。近年来,随着DNA荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,缩写为FISH)的不断发展,一种更直接的,在染色体甚至DNA纤维(extendedDNAfibre)水平上直接构建分子图谱的新方法正不断走向成熟。

DNA荧光原位杂交技术是80年代末才开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP),然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。FISH技术与其它原位杂交技术相比,除了具有不需要放射性同位素、实验周期短、检测灵敏度高等优点外,还由于它可以用不同的修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子,因此,可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到它们的相关位置和顺序。Ried等(1992)用3种不同标记的核苷酸,以不同的比例混合标记,在人的有丝分裂中期染色体(mitoticmetaphasechromosome)上可以同时检测到7个DNA探针。Dauwerse等(1992)已将FISH技术发展到可同时检测12种DNA探针分子。目前,FISH已成为一种最直接分析DNA序列在染色体或DNA分子上排列的分子细胞遗传学技术。它已被广泛地应用于动植物基因组结构(genomeorganization)的研究和DNA分子物理图谱(physicalmap)的构建(参见Joos等1994,Jiang等1994,Heiskanen等1996的综述)。

在用FISH技术构建DNA分子图谱时,它的分辨率(resolution)是指两个不同DNA探针能够被检测到的最小距离,也是最关键的技术指标。它将决定分子图谱的准确性和精密程度。在决定FISH分辨率的因素中,最重要的是所使用的靶DNA在染色体或DNA纤维上的浓缩度

(condensation),亦即DNA在染色体结构或DNA纤维上的三维空间包裹程度。浓缩度越高,分辨率越低。FISH技术的发展过程也正是分辨率水平由低向高不断进步的历程。

本文将结合对FISH技术在不同染色体或DNA纤维切片上的分辨率水平的分析,阐述这项技术在构建高分辨率的分子图谱中的应用前景。

1在中期染色体上的荧光原位杂交

早期的荧光原位杂交技术多以中期染色体作为靶DNA的载体。,另一方面制片技术也比较容易掌握。许多人都曾成功地在中期染色体上用FISH。一个典型的例子是Lichter等(1990)选用了50个人类第11条染色体的,,排列出所有探针在染色体上的顺序。进一步,DNA序列之间的相对关系,,由于使用的中期染色体已是DNA,FISH技术就不能分辨1～3Mb(百万碱基对)之间。类似的结(Lawrence等,1990;Trask等,1992)。然而,对于克隆一个只有几kb长度的基因来说,1～3Mb的分辨率水平是远不够的。另外,中期染色体还有一个缺点,由于染色体高度浓缩,对于一些基因组较小的种类,如酵母、Arabidopsis、番茄、水稻等,在光学显微镜下很难根据每条染色体的结构分辨出单条染色体,这也给构建图谱带来困难。

要提高FISH技术的分辨率水平,人们很容易想到使用浓缩度低的染色体作为靶DNA的载体。有人考虑到使用有丝分裂前期染色体(mitoticprophasechromosomes),Inazawa等(1994)报道通过同步化处理,可从人的淋巴细胞中得到拉长的前期染色体。在一个360kb的DNA分子区域内,用两色FISH技术在这种前期染色体上能够准确地观察到两个相距175kb的探针被分离开。但这种染色体切片不容易制备,而所能提高分辨率的能力有限,因此,用这种染色体切片进行荧光原位杂交的报道并不多见。Haaf和Ward(1994

)发展了一项技术,可用离心机械力将中期染色体拉长5～20倍。在这种拉长的中期染色体上进行荧光原位杂交,可将分辨率水平提高到200kb左右。但利用这种受机械力拉长的中期染色体,其染色体结构可能会受到一定程度的破坏,并且不同区域的染色体拉长的程度也可能不同,会给图谱的准确性带来人为的干扰。

2在减数分裂粗线期染色体上的荧光原位杂交

在分析了有丝分裂和减数分裂所有时期染色体的结构特征和进行高分辨率FISH的可能性之后,我们发现减数分裂粗线期(pachytene)是最理想的时期(Zhong等,1996a和Zhong等,1996b)。这一时期的染色体已经完成了同源染色体的配对,利用特殊的制片技术,可以分离到单条染色体,其长度通常比相应的中期染色体长10～20倍。而这一时期染色体的形态也十分特殊,着丝点(centromere)和端粒(telomere)结构很容易识别,并且每条染色体的异染色质(heterochromatin)和同染色质(euchromatin)区都有可识别的结构特征。以番茄为例,Ramanna和Prakken早在1967年就建立了一套根据粗线期着丝点的位置、短臂和长臂的比例以及异染色质和同染色质的结构特征来识别12条番茄染色体的方法。不久前,我们发展了一种从番茄花药的花粉母细胞中制备粗线期染色体的技术,能够分离到不带细胞质的单条粗线期染色体,并能根据Ramanna的方法识别出每条染色体,用番茄染色体的端粒重复序列(telomericrepeat)和端粒联接重复序列(telomere-associatedrepeat)作为探针,在这种染色体上进行两色荧光原位杂交,证实其分辨率能够达到低于100kb的水平(Zhong等1996b)。由此可见,以粗线期染色体作为靶DNA载体,不仅可以在不破坏染色体结构的情况下大大提高FISH的分辨率,还可弥补中期染色体不能识别单条染色体的缺陷。不过,FISH在粗线期染色体上的应用还要取决于制片技术的难易程度,对于有些动植物种类,提取性细胞是很困难的。

3在间期细胞核上的荧光原位杂交

在制备染色体切片时,很容易得到大量的间期细胞核。这些细胞核没有典型的染色体结构,但其染色质在这一时期却比分裂时期的染色体浓缩程度低很多,荧光原位杂交的分辨率也会比染色体高很多。Lawrence等(1988)首先观察到两个DNA。Trask等用50kb到1Mb范围里的DNA探针序列的间期细胞核荧光原位杂交分析表明DNA分子的直线距离有很强的相关性(Trask等,1989),两个相距50kb。用三色间期细胞核荧光原位杂交技术,Trask等()。但DNA2Mb之后相应减弱,这可能与间期细胞核中染DNA结构已比染色体上的浓缩度降低了许多,但它仍保持着细胞中原有的空间结构。FISH的分辨率水平只能达到50kb左右。

4在游离染色质上的荧光原位杂交

要突破FISH分辨率的限制,须考虑人为地改变染色质的原有空间结构。Heng等(1992)首先提出,用碱性溶胞剂(alkalinelysisbuffer)对处于G1 …… 此处隐藏：3902字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……