2015生物竞赛全国联赛部分解析 - 图文(4)

22.用超声波处理烟草基因组DNA后，用下列哪一个工程酶处理可以获得平末端片段，用于后续克隆：（单选）（B）

A. 限制性内切酶 B.大肠杆菌DNA聚合酶 C. Klenow片段 D. 反转录酶

【解析】

超声波打断的DNA片段，可能是平末端或者粘末端，获得平末端片段才方便连接T载体进

行后续克隆。

A：限制性内切酶处理后的切口，如果是从回文序列中间切的话是平末端，也可能是从回文序列两边切，结果是粘末端。并且随便用限制性内切酶，万一把自己的目的基因切断了更无法进行后续克隆了；

B：大肠杆菌DNA聚合酶是Klenow片段的来源，含有5'→3'外切酶活性，其实不太适合填补末端；

C：Klenow片段，又名DNA聚合酶I大片段（克列诺片段，Klenow fragment，或称克列诺酶，Klenow enzyme），是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶和3'→5'外切酶活性，但缺少完整酶的5'→3'外切酶活性，可用于填补DNA单链末端使之成为双链。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，而要用被切成平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个片段连接起来。

D：反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。本题是DNA的片段化和克隆，关系不大。

所以放着专门用来补齐超声碎裂片段的Klenow不选选B的答案是什么鬼？

除了Klenow片段以外还可以使用T4 DNA Polymerase，即T4 DNA聚合酶。这也是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以在结合有引物的单链DNA 模板上，从5'→3'方向催化DNA合成反应。T4 DNA Polymerase具有3'→5'外切酶活性，但也不具有5'→3'外切酶活性。

23. 下列哪个指标能证明大肠杆菌中成功表达了外源酶蛋白质：（单选）（D） A. 核酸杂交证明蛋白质表达 B. 在蓝白筛选中菌落呈现蓝色

C. RT-PCR能扩增外源基因 D. 纯化目的蛋白质具有酶活性

【解析】

A：核酸杂交：双链的核酸分子在某些理化因素作用下解开，在条件恢复后依据碱基配对原则形成双边结构。用于检测DNA或RNA分子的特定序列。这种方法可以检测外源基因是否成功定居于大肠杆菌体内，但并不能检测是否成功表达。

B：蓝白筛选：是在指示培养基上用颜色筛选重组克隆的方法。原理：野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。实验中使用是一种β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，它有一段基因突变造成编码的β-半乳糖苷酶失去一个短肽，从而失去活性。我们把外源DNA装载到质粒上运输进大肠杆菌。如果没加载上，质粒基因编码的α-肽链可以与这种缺失短肽的β-半乳糖苷酶互补，具有和正常β-半乳糖苷酶一样的活性，即可以生成蓝色物质；如果加载上了，那外源DNA就破坏了我们载体质粒上的α-肽链，细菌不能成功表达这种酶，菌落呈现白色。所以蓝白筛选是大肠杆菌是否成功加载重组基因的直接检测方法。

C：RT-PCR逆转录PCR，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。此方法可以说明外源基因已经成功加载并转录成RNA了，但由RNA到蛋白质的表达过程是否成功我们仍不知。 D：大肠杆菌表达外源酶蛋白质，直接可以想到大肠杆菌能够吸收外源基因产生蛋白质（酶）产物，我们纯化该产物蛋白，具有酶活性的话说明大肠杆菌表达成功。 所以本题选择D选项。

4.革兰氏染色是重要的细菌鉴别染色，影响革兰氏染色结果的关键因素是：（多选）（AE） A. 菌株培养时间 B.菌液稀释倍数 C. 涂片时间 D. 固定方式 E. 酒精脱色时间

【解析】

A：菌龄影响染色，菌龄老、陈旧的细菌培养物，以及菌体死亡或自溶，往往会由阳性菌转