酶工程复习材料 简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析

酶工程复习材料

1. 简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？

离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。

操作:a上样：上样体积不十分严格。b洗脱:增加溶液的离子强度 c梯度洗脱

法:改变溶液的pH

d再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。

凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。大分子

物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。

操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。

将干胶悬浮于5-10倍的蒸馏水中 ，充分溶胀，抽气，装柱。b柱的选择:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。c加样:体积不能过多，不超过凝胶床体积的5％，脱盐时可在10％左右。d洗脱:洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。e胶的保存:洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。

亲和层析原理:利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子.体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。

2. 酶的分类：

根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分；2.结合蛋白酶类

（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子） 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 根据酶蛋白结构特点可将酶分为

单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们

相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。

3. 酶合成调节的类型

诱导: 组成酶：细胞固有的酶类。

诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。 阻遏:分解代谢物阻遏和反馈阻遏

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4. 酶合成的调节机制：1.酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进

行。 2.末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

3.分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

5. 酶发酵动力学：主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度

以及环境因素对这些速度的影响等。

产酶动力学：主要研究细胞产酶速度以及各种环境对产酶速度的影响规律。分为宏观酶动力学和微观酶动力学

1. 细胞破碎确认： 1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数

器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。

2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力：

测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。

2. 固定化酶特点：1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，

以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。

3. 固定化酶的性质: 1. 稳定性2. 最适温度3、最适pH 4、底物特异性 (一) 稳定性：固相酶的稳定性比游离酶高，主要表现在以下几个方面。

（1）热稳定性：固定化酶热稳定性较之天然酶提高。如氨基酸酰化酶

(2) 对蛋白酶水解作用稳定性：固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋白酶水解作用的能力。

（3) 对变性试剂作用的稳定性：固相酶对各种蛋白变性剂的稳定性，一般都比天然酶强。

(4) 保藏稳定性：固相酶比天然酶保存的时间更长。 (二) 最适温度：(1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高，个别会有所降低

(2) 同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同

(三) 最适pH：酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适

PH的因素主要有两个: (1) 载体性质对最适pH影响(2) 产物性质对最适pH影响 载体性质对最适pH影响：用带负电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH

高。用带正电荷载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶最适pH低。用不带电荷载体制备的固定化酶，最适pH一般不改变。

影响的原因：因为固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这

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层不流动液体叫做扩散层，扩散层与其周围外部溶液之间存在着杜南（Donnan）平衡效应，即若是多阴离子载体就会吸引溶液中的阳离（如H+），使其附着于载体表面，导致扩散层的H+浓度比其周围外部溶液高，于是扩散层pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必须向碱侧偏移，才能抵消微环境作用，使固相酶达到最大效率，因此使用带负电荷的载体制备的固相酶，其最适pH比游离酶高。反之，亦然。（见示意图）

产物性质对最适pH影响:若酶催化反应产物为酸性时，固定化酶最适pH比游离酶的

最适pH要高。若酶催化反应产物为碱性时，固定化酶最适pH比游离酶的最适PH要低。若酶催化反应产物为中性时，固定化酶最适pH不变。

4.联系实验教学举例说明菌种分离的一般过程。

菌种分离的一般过程：土样的采取，预处理，培养，菌落的选择，产品的鉴定。 以枯草芽胞杆菌的分离为例：

②带菌土壤的热处理：称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。 ②配制分离选择培养基，灭菌备用。

③稀释制备菌液：取5支灭菌带帽15ml离心管，各加入无菌水9ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水50ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入1ml微生物悬液，混 合均匀后再取1ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取1ml 到第三支试管中，以此类推。 ④配制斜面培养基，灭菌备用。

⑤涂布培养：取 10-3、10-4、10-5、10-6稀释菌液各0.2ml，采用涂布和混合法形成8 个平板，倒置后在 37℃培养24-48 小时， 观察水解圈的形成，在无菌条件下将水解圈最大的菌落(水解圈/菌落最大者)转接种于斜面试管中在 37℃培养。

1. 酶生物合成的模式有哪些？阐述理想的酶合成模式。

酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型：霉合成与细胞合成生长同步。当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞进入平衡期后酶合成停止。其生物合成可被诱导，不受分解代谢产物和尾产物阻遏，对应的mRNA不稳定。延续合成型：酶合成伴随着细胞生长开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可延续合成较长的一段时间。可诱导，不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应mRNA相对稳定。中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后合成终止。受尾产物阻遏，其对应的mR …… 此处隐藏：3737字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……