荧光原位杂交法(6)

5.【适用仪器】

明确配套适用荧光显微镜的配置要求，至少包括对目镜与物镜的放大倍率、光源及滤光片要求。对显微镜配套耗材（如镜油）的要求进行介绍。

6.【样本要求】 重点明确以下内容：

6.1对适用样本的取材、固定、包埋与切片的具体要求。此部分内容可参考国际或国内相关标准操作性文件内容进行编写或引用。注意不同组织类型的样本应分别描述。

6.2样本的稳定性（包括蜡块与切片）。 7.【检测方法】

详细说明操作的各个步骤：

7.1明确检测需要的仪器与设备。如烤片机、恒温箱、水浴锅、染色缸、杂交盒等。注明货号及生产商（如需要）。

7.2试剂配制方法、注意事项，试剂开封、配制后使用方法及注意事项等。

7.3对于手工或半自动检测，详述脱蜡、煮片、消化、固定、核酸变性、杂交、洗涤和复染等各操作步骤。描述应尽量细化，需明确各步骤处理时间、温度、注意事项（如避光）等内容。

7.4对杂交后载玻片的储存及稳定性、复染后的储存及稳定性进行说明。

7.5详细说明质量控制情况：

建议实验室每次检测设置内对照和外对照（质控片），以对整体操作流程进行质量控制。评价指标应包括细胞结构的完整性，探针杂交信号的强度和位点的准确性，背景荧光强度，可计

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数信号（单色/双色）的细胞占全部细胞的比例等。

7.5.1内对照可为癌旁正常组织，明确样本检测的内对照使用原则，如“75%以上的肿瘤细胞核中都有杂交信号时，视为检测成功。”

7.5.2外对照可选择已知HER2基因扩增状态的组织切片或者细胞株，至少包括临界值以及无扩增样本。明确每一批次患者样本检测和更换使用新的试剂盒批次时，均应同时进行质控片检测，以监控检测性能并评估信号计数的准确性。分析质控结果不符合要求的原因并详述处理方式。

如试剂盒内不包含质控片，应明确配套使用的质控片信息，可以为商用质控片也可以为临床检测实验室自制质控片。自制质控片应为已知FISH结果的阴性和阳性质控片，详述质控片的制备方法。明确质控结果要求（试验有效性的判断），结果允许范围（如适用于不同的仪器或适用于手工与仪器方法，应分别列明结果的允许范围）。

7.6建议强调实验室检测相关的仪器设备需定期维护、校验，应建立完善的标准操作规范文件，从事检测的技术人员和病理医师应通过必要的培训和资格考核，做好记录和存档，内部定期对不同批次检测结果进行重复性分析；并积极参加相关的外部质控活动。

8.【阳性判断值】

根据相关指南及规范性文件，以HER2拷贝数平均值/细胞和/或HER2总拷贝数与CEP17总拷贝数的比值（双信号）的形式明确阳性判断值。

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9.【检验结果的解释】

9.1从细胞核形态、探针信号强度、背景情况等多方面，详述杂交后样本玻片的有效性评估标准。建议对不符合有效性评估标准情况发生时的常见问题及解决方法以列表的形式明确。

9.2明确目标区域的确定方法及仅对肿瘤细胞进行计数的要求；明确细胞计数的具体方法，包括每个样本初始读取细胞数及结果不确定样本的处理方法。明确HER2扩增异质性的处理方法。

可以列表的形式详述信号计数与阴阳性判定规则，应配合清晰彩图图例。例如对于浸润性乳腺癌，描述为“找到至少2个浸润癌区域，随机计数至少20个浸润癌细胞核中的双色信号，计算信号比值（比值=计数细胞核中红色信号总数/计数细胞核中绿色信号总数），根据以下标准对样本进行HER2基因扩增阴阳性的判断：比值≥2.0，或者比值