微生物检验操作规程(2)

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。

3.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

3.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 3.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 3.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 3.2 菌落总数的报告

3.2.1 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

3.2.2 菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 3.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 3.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

3.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

附录2

霉菌和酵母菌计数

1. 样品的稀释

1.1 固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即1:10稀释液。

1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

1.3 取1mL1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液。

1.4 按1.3 操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。 1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。

1.6 及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 2. 培养

待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 3. 菌落计数

肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。

选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 4. 结果与报告

4.1 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。

4.1.2 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多 不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4.1.3 若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 4.1.4 若所有稀释度平板均无菌生长，则以小于1乘最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。 4.2 报告

4.2.1 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。

4.2.2 菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用 0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效 数字。

4.2.3 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或 酵母数。

附件A

菌落总数、霉菌及酵母数检验流程图

附录3

大肠菌群计数

第一法 MPN计数 1. 样品的稀释

1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋制成1:10 的样品匀液。

1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。 1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。 2. 初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 3. 复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 4. 大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附件B，表1），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。 第二法 平板计数法 1. 样品的稀释 按第一法中的1进行。 2. 平板计数

2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

2.2 及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h～24h。 2.3 平板菌落数的选择

选取菌落数在15CFU～150CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。 3. 证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃ 培养24h～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 4. 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。 附件B 表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 0.10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 0.01 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 0.001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 MPN ＜3.0 3.0 3.0 6.1 6.2 9.4 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 …… 此处隐藏：2636字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……