实验二用DNA序列分析（学生版） - 图文

DNA序列测定与分析

原理：

DNA序列测定是现代的人们认识遗传信息及其表达的基础。DNA的序列测定有两种基本方法，Maxam-Gilbert化学降解法和Sanger法。现在全自动测序仍然沿用Sanger法。DNA测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息。 Sanger法

双脱氧核苷酸分子源于其脱氧核糖在3'位置的-OH基进一步脱氧。当它与其他正常脱氧核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常脱氧核苷酸一样参与DNA合成，以其5'位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的3'位置的-OH基结合，但是，由于它自身3'位置-OH基的缺失，至使下位核苷酸的5'磷酸基无法与之结合（图）。

图：双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的结构及DNA链合成终止反应

A.正常的DNA合成反应；B.ddNTP掺入到DNA合成反应后导致反应终止

正是基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于1977年建立了以双脱氧链终止法为基础来测定DNA序列的方法。该方法以待测单链或双链 DNA 为模板，使用能与DNA模板结合的一段寡核苷酸为引物，在DNA多聚酶的催化作用下合成新的DNA链。当这个反应体系中加入了一种放射性同位素 33P标记的双脱氧核苷酸（*-ddATP 或 *-ddCTP 或 *-ddGTP 或 *-ddTTP）后，在DNA合成过程中，标记的*-ddNTP将与相应的dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中，这样DNA互补链的延伸则到此终止。而双脱氧核苷酸的掺入是随机的，故各个新生 DNA 片段的长度互不相同。过程如图所示。不同长度DNA片段在凝胶中的移动速率不同，而聚丙烯酰胺凝胶分辨率极高，通过能分辨出相差一个碱基长度的DNA片段，从而将混合产物中不同长度DNA片段分离开，再通过放射自显影曝光，根据片段尾部的双脱氧核苷酸读出该DNA的碱基排列顺序（图）。 Q1：简单叙述Sanger法的工作原理。

图：DNA链合成终止反应后的片段

图：Sanger法人工测序的结果

Q2：请给出上图的测序结果（至少20bp，必须从5’到3’。）叫上两个同学讲解顺序大家评价。

注意，讲清楚图中的较弱条带，识别真假结果。

DNA自动测序

基于Sanger双脱氧链终止法的原理，只不过不用同位素标记ddNTP，而是用四种不同的荧光染料分别标记ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基。延伸中的 DNA 互补链分别终止于不同荧光标记的ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。序列结果如图所示，在实际测得的一段DNA序列结果中，红色代表T；绿色代表A；兰色代表C；黑色代表G。DNA序列自动给出。注意，DNA自动测序采用的是毛细管电泳来分离DNA片段的。

图：自动测序的结果（提醒：测序峰的质量控制：掐头去尾，之后检查各个峰的质量，特别

是G有时峰的高度很低或有背景峰的出现，都要谨慎辨别）。 DNA测序的策略：

引物依次推进法：是从目的片段的一端开始，利用载体上的序列为依据，设计第一次反应的反应引物进行测序，然后，依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，递进测序，直至完成。引物依次推进法需要多次设计和合成引物，比较繁琐；对于重复序列较多的目的 DNA，由于引物的非特异性结合概率高，所以该方法不适合于测定含有多重复序列的 DNA 片段。注意，在设计下一个引物时，上一个引物测序得到的可靠顺序的最后一个碱基之前的100-200bp之间寻找和设计合成新的引物。

鸟枪法：是将待测DNA超长克隆于克隆载体上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化，得到两端彼此重叠的、但部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。许多物种的基因组DNA序列都是利用鸟枪法获得的。

图：鸟枪法策略

DNA序列分析-Primer Premier软件简介（演示和实际练习）：

图：步骤一A

图：步骤一B

图：操作中注意事项，请将红圈处的选择取消

Q3：给出实际测序结果A并确定可靠的顺序，寻找Kozak顺序，若有Kozak顺序，在起始密码子到最后一个可靠碱基之后人为加入TAAaTAAaTAA，为的是人为加入终止密码子，然后用Primer Premier软件翻译该ORF并给出头20个氨基酸的顺序（但是不要使用起始密码子之前的、包括Kozak的任何顺序，并以TAAaTAAaTAA结尾）；给出实际测序结果B并确定可靠的顺序，然后用Primer Premier软件找到可能的转录因子结合位点；用Primer Premier软件在可靠的实际测序结果A和B中可靠顺序内寻找酶切位点（限EcoRI, EcoRV, BamHI, ClaI, HindIII, XbaI, XhoI, NotI, BglII, KpnI, SalI, PstI），并以适当比例绘制限制酶切图。请一位同学上前配合，师生一同展示，可以不用自己的电脑。

Q4：（可简单了解下一代测序方法），请比较下一代测序方法和Sanger法的优缺点？可即时网上查找。

确定DNA测序引物（含PCR设计引物）：

根据个人实践中的多年经验 ，给出个人测序的一些原则。1- 引物长度 20-25碱基，引物的位置应在待测起始位置之前至少50bp；2- 尽量避免三个以上相同碱基的重复，尤其是G或C；3- GC含量在50-60%最佳，且GC对AT四种碱基的排列尽量均匀，最好最后一个碱基是G或C；4- 没有发夹结构；5- 引物自身之间不形成二聚体结构；6- 用10mM Tris缓冲液（PH=7.5-8.0）溶解。7- PCR时要考虑模板的GC含量，有目的地设计PCR反应条件；8- PCR时，引物可以适当用BLAST软件分析是否引物具有很高的特异性或者一对引物是否不是在同一外显子内的（如果只扩增cDNA而不是基因组DNA）；9- PCR时可设计添加额外的顺序，针对后续不同的目的。10- PCR产物越长，则产物的正确性越高；11- 模板的某些特殊顺序可能干扰测序的成功。

Q5：根据给定模板DNA顺序A和下游要测的未完成部位，设计一个下游引物并说明该对引物扩增的产物的长度（bp）。 附件：SD and Kozak

在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段高度保守的富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16S rRNA 3’端识别，帮助从起始密码子AUG处开始翻译。它是1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现的，故命名为SD序列（Shine-Dalgarno Sequence）。大肠杆菌（E.coli）中的SD序列为AGGAGGU。SD序列可以帮助核糖体区分起始密码子AUG与mRNA序列当中编码Met氨基酸的AUG密码子。并非所有原核生物mRNA上都有SD序列，比如在许多革兰氏阴性菌的mRNA上就没有SD序列,有其它办法可以保证翻译的起始效率。这些细菌的核糖体蛋白S1（又称为rpsA）可以结合到起始密码子AUG上游15到30个碱基处富含AU的序列上，从而介导核糖体识别起始密码子。真核生物mRNA上也有一个功能类似SD序列的保守区段称为Kozak sequence它位于起始密码子AUG（通常后面又是一个G）上游3个碱基的位置，与起始密码子一起形成gccRccAUGG的一段保守序列（R是嘌呤）。

致谢：部分文字和图表参考了网络资源，一并向网络资源提供者致谢。