桑树WRKY转录因子的全基因组鉴定及生物信息学分析(3)

　　基因结构中内含子数量及相位类型是研究基因进化的重要证据。根据剪接中位置的不同，内含子分为3种相位类型，0型内含子位于2个密码子之间，1型内含子位于密码子的第1和第2碱基之间，2型内含子位于密码子的第2和第3碱基之间（Sharp，1981）。内含子相位的改变会导致后续阅读框发生变化，因此内含子的相位通常比较保守。本研究中，桑树WRKY家族蛋白主要分为三大类（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），且有2个蛋白（MnWRKY49和MnWRKYlC）未进行分组，与Baranwal等（2016）将桑树WRKY转录因子家族分为四类的研究结果基本一致。本研究还发现，同一进化组的基因结构内含子数量和相位类型高度一致，进化组Ⅱa和进化组Ⅱb的内含子相位类型全部为0型，进化组Ⅱd、进化组Ⅱe和进化组Ⅲ全部为2型。约50%桑树WRKY转录因子家族基因包含2个内含子，其中有25个基因的内含子相位为2-2型，分别属于进化组Ⅱc、进化组Ⅱd、进化组Ⅱe和进化组Ⅲ，推测其来源于共同的祖先基因。

　　本研究的系统进化分析结果显示，桑树WRKY家族蛋白主要分为三大类，Ⅱ类又分为5个亚组。所有成员均含有保守基序WRKYGQK（MnWRKY50和MnWRKY51为WRKYGKK外），Ⅰ类和Ⅱ类还包含有保守的锌指结构C2H2（除MnWRKY28和Mn-WRKY54缺少外），Ⅲ类的锌指结构为C2HC。Rinerson等（2015）研究认为，植物中WRKY转录因子家族基因存在两种可能的起源方式，一种起源于Ⅰ类蛋白C端WRKY结构域，一种起源于藻类Ⅱa或Ⅱb的某一蛋白结构域。桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析发现有五类Motif的保守性较强，所有桑树WRKY蛋白中均包含C端Motif1，Ⅰ类蛋白同时含有N端Motif3。进化组Ⅱa、进化组Ⅱb和进化组Ⅲ中含有类似LRR结构域的Motif5。可见，植物WRKY转录因子基因家族结构上高度保守，桑树WRKY转录因子可能起源于I类基因蛋白C端WRKY结构域。

　　WRKY蛋白特异性结合DNA的最小基序TTGAC（C/T）称作W-box。多数WRKY转录因子的目标基因启动子中均含有数量不定的W-box，彼此间或同向排列或形成回文结构，WRKY转录因子与其结合，而调节下游功能基因或其他转录因子的表达（Eulgemetal.，2000）。一些植物WRKY转录因子家族基因启动子中也存在W-box，如拟南芥WRKYl8启动子中的W-box是起负调控作用的顺式作用元件，能阻止拟南芥WRKYl8在抗病期间的过量表达，从而缓解该基因对植物生长造成的影响（ChenandChen，2002）。多种WRKY转录因子可形成复合物以调控植物的抗病性。Baranwal等（2016）研究发现，桑树WRKY基因上游启动子区富含AAAG、GAAAA和AGAAA等序列。本研究也发现桑树WRKY转录因子家族基因启动子区的AAAGC、AAAAAGT和GAAAAAG数量较多，且部分桑树WRKY转录因子家族基因启动子区含有bZIP、ERF、GT-1、MYB、TGA和WRKY转录因子结合序列，而这些转录因子大多与逆境胁迫有关。

　　桑树WRKY转录因子家族基因同时受碱基突变和正向选择压力的影响，其中以碱基突变选择压力占主导地位。基因密码子使用偏性与植物基因组组成及其所处的胁迫环境有直接关系（宋辉等，2015）。双子叶植物偏好A/T结尾的密码子，单子叶植物偏好G/C结尾的密码子（Tatarinovaetal.，2010），偏性强的基因偏好使用G/C结尾的密码子（Gu0etal.，2007）。桑树属于双子叶植物，虽然RSCU>1.000的密码子中以A/T结尾的略多，但密码子使用偏性并不强，多数属于低表达基因。Baranwal等（2016）研究发现，桑树WRKY转录因子家族基因表达具有器官特异性，在54个WRKY转录因子家族基因中有13个基因在根部表达，25个基因在树皮中表达，10个在雄蕊中表达，但总体来看，检测到的表达基因数目较少，基因相对表达倍数不高。这在本研究中得到进一步证实，即桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性较弱。

　　4结论

　　桑树WRKY转录因子家族包含55个成员，内含子相位类型一致的同组成员可能来源于同一祖先基因，且与基因复制和基因组重排事件有关；蛋白序列高度保守，多数含有完整的WRKYGQK和锌指结构，在植物抵御环境胁迫过程中发挥作用；基因密码子使用偏性较弱，主要受碱基突变选择压力影响，多数属于低表达基因，表明桑树受环境胁迫压力较小。

　　作者：刘潮等