桑树WRKY转录因子的全基因组鉴定及生物信息学分析

　　摘要：[目的]明确桑树基因组中WRKY转录因子家族结构及其功能特征，为进一步揭示WRKY转录因子家族生物学功能提供科学依据。[方法]利用生物信息学方法对桑树WRKY转录因子的数目、类型、结构、系统进化关系、保守结构域和密码子使用偏性等进行全面分析。[结果]基于桑树全基因组蛋白数据库，共鉴定出55个桑树WRKY转录因子家族基因，占桑树基因总数（29261）的1.88%。桑树WRKY转录因子存在6种内含子数量类型及15种内含子相位类型，其中27个基因含有2个内含子，25个基因的相位类型为2-2型。保守结构域系统进化分析结果显示，桑树WRKY转录因子家族蛋白主要分为三大类（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），I类可分为IN和Ic两个亚组，Ⅱ类根据聚类情况又可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5个亚组。桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析发现有五类Motif的保守性较强，桑树WRKY转录因子蛋白中均包含c端Motif1，I类蛋白同时含有N端Motif3。桑树WRKY转录因子家族基因启动子区富含PBF（C2H2锌指因子）和AHL（拟南芥hook因子）元件。密码子使用偏性分析结果显示，桑树WRKY转录因子家族基因的有效密码子数（ENC）介于48.00-60.00，密码子第3位GC含量（GC3s）介于0.330-0.722，平均亲水性值（Gravy）均为负值；同义密码子相对使用度（RSCU）>I.000的密码子有29个，且以A（6个）或T（11个）结尾较G（4个）或c（8个）结尾的略多。[结论]桑树WRKY转录因子家族包含55个成员，内含子相位类型一致的同组成员可能来源于同一祖先基因，且与基因复制和基因组重排有关；蛋白序列高度保守，在植物抵御环境胁迫过程中发挥作用；基因密码子使用偏性较弱，主要受碱基突变选择压力影响。

　　关键词：桑树；WRKY转录因子；密码子使用偏性；系统进化；生物信息学

　　0引言

　　[研究意义]WRKY转录因子家族是仅存于高等植物中的一类锌指蛋白，参与植物的生长发育，能对环境胁迫和病原侵染作出响应。首先，WRKY转录因子蛋白在植物免疫反应中发挥重要作用，是植物免疫系统各通路的中心组件，包括MTI、PTI、ETI、基本防御及系统获得抗性（Birkenbihletal.，2016）。其次，WRKY转录因子在植物的应激反应中也起关键作用，其网络涉及生物和非生物胁迫的各组成部分（Eulgem，2006；Zhuetal.，2013）。WRKY转录因子家族基因过表达能增強植物对盐和干旱胁迫的耐受性，同时增强抗病性（OiuandYu，2009）。此外，WRKY转录因子还在植物种子发芽、衰老及其他发育反应中发挥重要作用（Rushtonetal.，2010；Verweijetal.，2016）。密码子使用偏性是指各种生物体偏爱使用三联密码子（编码相同氨基酸的同义密码子）的现象，普遍存在于生物界中，且物种的亲缘关系越近密码子使用偏性越相似；密码子使用偏性还与基因表达、蛋白质功能等密切相关。因此，研究密码子使用偏性对开展基因进化压力研究、基因表达水平预测及外源基因改良等均具有重要意义。[前人研究进展]WRKY转录因子家族含有60个高度保守的氨基酸WRKY功能域，包含N端的WRKYGQK保守的氨基酸和C端非典型的锌指结构（Rushtonetal.，2010）。根据WRKY结构域数量和锌指结构氨基酸组成的不同，可将WRKY转录因子家族蛋白分为三大类：第1类含有2个WRKY结构域，具有Cys2-His2型（CX46CX22-23HX1H）锌指结构；第Ⅱ类和第Ⅲ类仅含有1个WRKY结构域，其中第Ⅱ类的锌指结构与第1类的类似，第Ⅲ类的锌指结构为Cys2-His-Cys型（CXvCXE3HTC），根据保守氨基酸残基的差异，第Ⅱ类又可分为5个亚类（Eulgemetal.，2000）。至今，已有多种植物WRKY转录因子家族基因被鉴定（Wuetal.，2005；Rossetal.，2007；Lingetal.，2011；HuangetaL，2012；DmgetaL，2015；Songetal，2016；Zhangetal.，2016），并证实WRKY转录因子家族参与植物的多种生理生化过程，包括衰老（zhangetal.，2016）、纤维发育（Dingetal.，2015）、生物和非生物胁迫（Songetal.，2016；Weietal.，2016）等。不同物种或同一物种不同基因问的密码子使用偏性不同，与基因在进化过程中所面对的选择压力不同有关。物种在进化过程中受基因突变压力和自然选择压力的双重影响，但由于二者在基因进化过程中所发挥作用的权重不同，导致密码子使用偏性具有物种特异性（赵洋等，2016；曲俊杰等，2017）。密码子使用偏性与GC含量有关时表示受突变压力影响（Chenetal.，2004），与翻译过程有关时表示受正向选择压力影响（Sharpetal.，2010）。因此，通过优化密码子可提高外源基因在寄主细胞中的表达水平（周宗梁等，2012；Zelaskoetal.，2013）。[本研究切入点]桑树（Morusnotabilis）是一种常见的落叶乔木，其叶片是桑蚕的主要饲料，桑皮可用作造纸原料，桑果可供食用或酿酒，在我国多个省份均有栽培，但目前针对桑树WRKY转录因子基因及其蛋白的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]在桑树基因组测序工作的基础上，利用生物信息学方法全面预测分析桑树基因组中WRKY转录因子家族结构及其功能特征，为进一步揭示WRKY转录因子家族生物学功能提供科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1蛋白序列获取与鉴定

　　桑树全基因组蛋白序列从GenBank数据库中搜索获得，以拟南芥WRKY转录因子蛋白序列为探针，在桑树全基因组蛋白数据库中进行BLASTp同源序列比对分析，通过NCBI在线工具CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）进行蛋白结构域分析，并剔除无WRKY结构域的蛋白序列。

　　1.2基因及其蛋白结构分析

　　从NCBI中获得桑树WRKY转录因子基因序列和CDS序列，使用基因结构显示系统（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）绘制基因结构示意图；通过MEMESUITE（http：//meme-suite.org/tools/meme）預测桑树WRKY转录因子蛋白序列保守氨基酸Motif，参数设为默认值。

　　1.3基因启动子区特征分析

　　通过GenBank数据库获取桑树WRKY转录因子家族基因转录起始位点上游的2kb序列，以JASPAR（http：//iaspar.genereg.net/）数据库分析启动子区富含转录调控基序。选择植物启动子基序数据库作为搜索数据库，相对阈值分数选择100%。

　　1.4蛋白系统进化分析

　　所有桑树WRKY家族蛋白通过Clustalx进行比对分析，选取WRKY和锌指结构域保守序列，采用MEGA5.0中的NJ（Neighbor-jioining）法构建系统发育进化树，参数选择Bootstrap为1000。系统发育进化树的绘制与优化使用Itol在线工具（http：//itol.embl.de/）完成。 …… 此处隐藏：1465字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……