桑树WRKY转录因子的全基因组鉴定及生物信息学分析(2)

　　1.5基因密码子使用偏性分析

　　利用CodonW1.4.4对桑树WRKY转录因子家族基因CDS序列密码子的使用偏性进行分析，包括密码子适应指数（CAI）、有效密码子数（ENC）、密码子第3位GC含量（GC3s）和平均亲水性值（Gravy）等参数。以GC3s为横坐标、ENC为纵坐标绘制ENC-plot图谱。图谱中的曲线为ENC预期值，表示密码子使用偏性仅由碱基组成决定，计算公式为：ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+（1-GC3s）2]。分布点越靠近标准曲线表示密码子使用偏性受碱基突变影响越大，越远离标准曲线表示密码子使用偏性受自然选择影响越大。使用EMBOSSexplorer网站（http：//emboss.toulouse.inra.fr/）在线软件Cusp对同义密码子的相对使用度（Relativesynonymouscodonusage，RSCU）进行分析。

　　2结果与分析

　　2.1桑树WRKY转录因子家族成员鉴定及其序列分析结果

　　基于桑树全基因组蛋白数据库，经BLASTp同源搜索和SMART保守结构域鉴定，共获得55个桑树WRKV～录因子基因（表1），占桑树基因总数（29261）的1.88%。其中，蛋白氨基酸残基数小于300aa的基因序列占24%，介于300-650aa的基因序列占71%，大于650aa的基因序列占5%。

　　桑树WRKY转录因子家族基因存在6种内含子数量类型（图1）。其中，有27个基因含有2个内含子，为数量最多的类型；有10个基因含有4个内含子；WRKY9基因的内含子数量达14个，为内含子数量最多的类型。桑树WRKY转录因子家族基因内含子相位类型有15种，呈多样性。其中，有25个基因的内含子相位为2-2型，是基因数量最多的类型；有6个基因的内含子相位为2型。进化组Ⅰ和进化组Ⅱc中的基因内含子数量和相位类型较多样，说明组内基因来源较复杂；进化组Ⅱa、进化组Ⅱb、进化组Ⅱd、进化组Ⅱe和进化组Ⅲ中的基因结构和内含子相位类型高度一致，内含子相位为2—2型，可能是由同一祖先基因复制而来。

　　2.2桑树WRKY家族蛋白的系统进化分析结果

　　利用MEGA5.05对72个拟南芥WRKY转录因子蛋白和55个桑树WRKY转录因子蛋白的保守结构域序列进行系统进化分析，结果显示，桑树WRKY转录因子蛋白主要分为三大类（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），其中，第Ⅰ类根据WRKY保守结构域处于N端或C端，可分为ⅠN和ⅠC两个亚组；第Ⅱ类根据聚类情况又可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5个亚组（图2）。但MnWRKY49和MnWRKYlC未归入以上分组。

　　2.3桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析结果

　　使用MEMESUITE对桑树WRKY转录因子保守氨基酸Motif进行分析，结果发现有五类Moti啪保守性较强，其正则表达式如图3所示。其中，Motif1是WRKYMotif，在桑树WRKY转录因子家族中高度保守；Motif3为进化组IN端的WRKY保守结构域；Motif2为锌指结构，仅MnWRKY28、MnWRKY43和MnWRKY54缺少该结构域。55个WRKY转录因子蛋白均具有Motif1，所有I类基因蛋白均具有Motif1和Motif3。Motif4为未知结构域，Motif5为LXsLXgLX3L基序，类似LRR结构域，进化组I、进化组Ⅱa和进化组Ⅱc的基因蛋白结构包含Motif4，进化组Ⅱa、进化组Ⅱb和进化组Ⅲ的基因蛋白结构包含Motif5。部分桑树WRKY转录因子保守结构域和锌指结构存在变异，如进化组Ⅱc中MnWRKY50和MnWRKY51的保守结构域为WRKYGKK，MnWRKY28和MnWRKY54的锌指结构缺少CX.sCX22.23部分，进化组Ⅲ中MnWRKYl9和MnWRKY23的锌指结构分别为CX7CX23HRC和CX7CX23HIC，保守氨基酸残基发生变异。

　　2.4桑树WRKY转录因子家族基因启动子区特征分析结果

　　桑树WRKY转录因子家族基因启动子区均含有PBF结合元件（AAAGC），每个基因启动子平均含有4.8个元件（表2），PBF属于Dof家族C2H2锌指因子类，有助于bZIP转录因子结合DNA（Vicente-Carbaiosaetal.，1997）；另外两种C2H2锌指因子类（DOF2.4和DOF5.3）含量也较高。55个桑树WRKY转录因子家族基因中有28个基因的启动子区含有AHL20结合元件（AATTAAAT），AHLl2与AHL20转录因子均属于拟南芥hook因子，能特异性结合与核基质附着相关且富含AT的DNA序列，通过下调PAMP引发的NH01和FRKl可负调控植物对病原菌的先天性免疫作用（Luetal.，2010）。此外，部分桑树WRKY转录因子家族基因启动子区含有bZIP、ERF、GT-1、MYB、TGA和WRKY转录因子结合序列。

　　2.5桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性分析结果

　　为了解桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性，对ENC、GC3s和Gravy等参数进行分析，结果发现，桑树WRKY转录因子家族基因ENC介于48.00-60.00，GC3s介于0.330-0.722，Gravy均为负值（表3），表明桑树WRKY轉录因子蛋白均为亲水性蛋白，且多数具有强亲水性。

　　ENC与GC3s的关联分析结果显示，基因分布越靠近ENC-plot图谱标准曲线表示密码子使用受碱基突变压力影响越大，基因分布在标准曲线下方或远离曲线，表示基因受自然选择压力影响越大。GC3s分布则反映植物所受的选择压力，GC3s分布越广泛，表明密码子使用偏性受碱基突变压力越大，GC3s分布范围越小，表明密码子使用偏性受正向选择压力影响越大（KawabeandMivashita，2003）。由图4可知，桑树WRKY转录因子家族基因的GC3s介于0.330-0.722，分布较广泛，且多数基因ENC分布在标准曲线下方，表明桑树WRKY转录因子家族基因同时受到碱基突变和正向选择压力的影响。

　　RSCU是同义密码子实际使用量与理论使用量的比值。RSCU>1.000，表示密码子使用频率高于其他同义密码子；反之则使用频率低。由表4可知，RSCU>I.000的密码子有29个，且以A（6个）或T（11个）结尾较G（4个）或C（8个）结尾的略多，说明桑树WRKY转录因子家族基因的密码子使用偏性较弱，略偏好A或T结尾。

　　3讨论

　　WRKY转录因子蛋白为植物特有转录因子家族，广泛参与植物多种生物学进程的调控。至今，多个已完成基因组测序植物的WRKY转录因子家族基因被鉴定，番茄基因组中有81个WRKY转录因子家族基因（Wuetal.，2005），黄瓜有55个WRKY转录因子家族基因（Rossetal.，2007），大豆有176个WRKY转录因子家族基因（Lingetal.，2011），棉花有113个WRKY转录因子家族基因（Huangetal.，2012），粳稻有98个WRKY转录因子基因（周宗梁等，2012），拟南芥有72个WRKY转录因子家族基因（Zelaskoetal.，2013），苹果有132个WRKY家族基因（谷彦冰等，2015）。Baranwal等（2016）研究发现，桑树基因组中含有54个WRKY转录因子基因。同一家族基因的数量与植物进化过程中基因复制、基因组重排等有关，如水稻、番茄、苹果和棉花的WRKY转录因子家族均存在基因复制现象（Wuetal.，2005；Huangetal.，2012；周宗梁等，2012），但在WRKY转录因子数量较少的黄瓜中未发现基因复制现象（Rossetal.，2007）。WRKY转录因子基因数目除了与物种基因组有关外，还与植物进化过程中所受的环境压力有关。本研究结果显示，桑树WRKY转录因子家族基因数量为55个，属于WRKY转录因子家族基因相对较少的物种类型，说明进化过程中该家族基因受到的环境压力较小。 …… 此处隐藏：1835字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……