2017-2018学年高中生物 第4章 现代生物技术 第15课时 聚合酶链式

第15课时聚合

酶链式反应技术

[学习导航] 1.阅读教材P77～78内容，掌握PCR技术原理。2.结合教材P79～80内容，了解PCR 技术的基本操作过程，讨论PCR技术的影响因素。

[重难点击] 1.简述PCR的原理。2.了解PCR技术的基本操作过程并讨论PCR技术的影响因素。

一、PCR的原理

聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的，请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识，分析PCR的原理。

1.DNA的平面结构示意图

2

(1)写出各个标号的名称①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鸟嘌呤核糖；④胸腺嘧啶；⑤脱氧核糖；⑥磷酸基团；⑦胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；⑧氢键；⑨碱基对；⑩一条脱氧核糖核苷酸链。 (2)DNA 的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA 链的方向，通常将羟基末端称为3′端；将磷酸基团的末端称为5′端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。 答案 左链上5′端，下3′端；右链上3′端，下5′端。 2.细胞内DNA 复制条件分析

3.PCR 原理与反应过程

(1) PCR 概念：是一种体外酶促合成特定DNA 片段的技术，它能以极少量的DNA 为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA 拷贝。 (2)条件及作用

(3)反应过程 ①变性

温度上升到94～98 ℃时，目的DNA 双链变性解旋为单链模板。 ②复性

温度下降到40～60 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合。

③延伸

温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐热的Taq DNA聚合酶的作用下。根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

④循环：继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。若开始加入了N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得N·2n个DNA片段。

1.PCR原理

PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。

答案不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。

2.PCR反应过程

(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？

答案PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。

(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。

答案每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。

(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？

答案DNA的羟基(—OH)末端为3′端，磷酸基团的末端为5′端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

3

1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是( )

A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链

B.DNA复制不需要引物

C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D.PCR扩增的对象是氨基酸序列

答案 C

解析DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链；引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；PCR 扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。

2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：

(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是_________。

(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶，该酶是从____________________中分离的。

(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是______________。

(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在______________中才能进行，并且要严格控制________条件。

(5)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是____________________________。答案(1)DNA的热变性原理(2)水生耐热细菌Taq(3)耐高温(4)一定的缓冲溶液温

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度(5)2 作为DNA复制的起点

解析(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。

(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。

(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。

(4)PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。

(5)PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

一题多变

细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？

答案需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。

易错提醒与PCR原理有关的三个易错点

(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。

(2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。

二、DNA片段的PCR扩增和产物检测

DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。阅读教材，完善下列内容：

1.DNA片段的PCR扩增

准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上

↓

移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分

↓

混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

↓

离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是使反应液集中在离心管底部

5

↓

反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应

(1)加入离心管中的物质应包括：模板DNA、Taq DNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核苷酸、2种引物、缓冲液。

(2)离心管中要加入少量石蜡油，目的是防止反应溶液的挥发。

(3)热循环仪的反应程序应设定为：

(4)影响因素：在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间越长；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就越低，反之引物越长，G、C含量越多，复性温度就越高，这是因为G、C 之间是由3个氢键连接，A、T之间是由2个氢键连接。

(5)PCR过程中，循环次数是不是越多越好？

答案不是。Taq DNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1×10－5的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在25～35个循环。

2.扩增产物的检测

(1)原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要 …… 此处隐藏：11568字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……