残余牛血清蛋白ELISA检测方法的建立及其初步应用

建立检测疫苗中残余牛血清蛋白(CSP)含量的ELISA检测法。将混合的小牛血清分别免疫鸡和家兔,然后分别提取、纯化鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)和兔抗小牛血清抗体IgG。IgY用作包被抗体,IgG用作酶标抗体,四甲基联苯胺(TMB)显色检测残余CSP含量。

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标记免疫分析与临床

20 0 5年 6月第 1 2卷第 2期

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残余牛血清蛋白 E I A检测方法的 LS建立及其初步应用李华，建昆，俞洪超，润乡，龙翟友刚，琼芳，萍芳，雪凤，忠平徐崔丁谢

(国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所质量检定室，南昆明 60 1 )中云 5 i 8

摘要：建立检测疫苗中残余牛血清蛋白( P含量的 E IA检测法。将混合的小牛血清分别免疫鸡和家兔， CS ) LS然后分别提取、纯化鸡卵黄免疫球蛋白(g和兔抗小牛血清抗体 IG。IY用作包被抗体，g用作酶标抗体， IY) g g IG四甲基联苯胺 ( TMB显色检测残余 CS ) P含量。结果：包被用 IY的最适浓度为 2— 3,/n用含 0 4明胶的 g 5 O g rL, u . 0 O mo/ B ( H7 4溶液作为包被缓冲液， P IG的最适稀释度为 1 2 0 -:0 0 . l lL P S p . ) HR - g:0 01 3 0。该方法的检测灵敏度为 2 5 g mL,异系数为 6 3 .n/变 .%~ 9 4, .回收率为 9 . 一 l 2 8,猪、、鼠血清皆无交叉反应。1 O4 1. 与猴豚 O批不含Al0H)的疫苗 E I A法与 RP (。 LS HA法 (相间接血凝法 )测结果无显著性差异 (反检 P>0 0 )而 1 .5; O批含 Al0H)的疫苗，两种方法检测结果相差很大 ( (。 P< O 0 ) . 5。建立的 E I A检测法不受 AIOH) LS (。的影响，简便、 特异和灵敏，更适用于检测生物制品中的残余 C P S。关键词： L S 残余牛血清； AlOH);反相间接血凝方法 E IA; (。中图分类号： 4 6 6 R 4. 1文献标识码： A文章编号：0 6i 0 ( 0 5 0— 1 70 1 0 -7 3 2 0 ) 20 0—3

De e o v l pm e nd Pr m a y Applc ton of ELI A e ho o nt a i r ia i S M t d fr

De e tng Re i a l r m o e n t c i sdu lCa fSe u Pr t iLI H u,YU in k n,H ONG a,e 1 a Ja - u Ch o ta .( nsiu eo

e c lBi o y,Chie e Ac de fM e ia ce c s I tt t fM dia olg n s a my o d c lS in e,Pe n non M e c lCol g kig U i dia l e,K u m ig 6 01 8, e n n 5 Chia) 1 n

Ab t a t To d v l p a n w sr c: e eo e DAS ELI A ( o b e a tb d a d c _ S d u l n i o y s n wih ELI A ) k tf r d t c i g S i o e e tn r sdu l afs r m r t i ( P)i a cn s afs r r m if r n it itwe e p o e n e i a l e u p o en CS c n v c i e,c l e a fo d fe e td s rc r o ld a d u e o i m u ier b isa d h nsr s e tv l .T h n,t e I s d t m n z a b t n e e p c i ey e h gY r m o k a d t n i fo y l n hea t CSP I G— gf o r b i we e s p r t d a d p r fe . Th u ii d I Y s u e s t e c a i g a t b d r m a b t r e a a e n u ii d e p rfe g wa s d a h o tn n i o y。

a d p rfe a b ta t CS g wa a ee y H RP. Th p i lc n e t ai n o g wa n u iid r b i n i — P I G s lb ld b e o tma o c n r to fI Y s

2—0￣/ .Th o t g b fe s0 0 mo/ B p . )c n ann . gu i. Th 53/ mL g ec ai u frwa . 1 lL P S( H7 4 o ti ig 0 4 n lt n eo tma iu ins o RP I G e e fo p i l l to f H d—g w r r m 2 0 o 1: 0 0 The s nstv t f t i ELI A 1: 0 0 t 3 0 . e ii iy o h s S

meh d wa ih r( pt . n/ )t a h t f u rn H A, h a i inc ef in s t o shg e u o2 5 g mL h nt a re t o c RP t ev r to o f

ce t a i waa o t 6 3一 9 4,a d t e r c v r a e w a 0 4一 1 2 8 . Fu t e m o e h r a o b u . . n h e o e y r t s9 . 1. r h r r,t e e w s n

c o sr a to t e ao i r s— e c in wih s r fp g,m o k ya d g i e i. T we t o so a cn swih AI O H ) n e n un apg n y l t fv c i e t ( 3 o t o tA l O H ) r e td b r wih u ( 3we e t s e y ELI A n S a d RPH A e p c iey Th e u t r v d t a r s e tv l . e r s ls p o e h t

t ea jv n f ( h du a to 0H ) h dfwe fu n e nEL S t a nRP Al 3 a e ri le c I A h no HA, h a it n o RH A n o t ev r i f ao Pa o g d fe e t l t o a cn s wa o e sgnfc n h n ELI A . T h m n ifr n o s f v c i e s m r i iia t t a S e ELI A e h d i S m t o S a h g l e ii e a d u e u t o O d t c P i a cn s i h y s nstv n s f lme h d t e e tCS n v c i e . Ke r s ELl A; Re i u lc l s r m r t i Al O H ); RPH A y wo d: S sd a af e u p o en; ( 3

牛血清是目前各种疫苗生产中使用的主要原辅材料，于人体是一种异种蛋白和过敏原，国对我现行生物制品规程中规定其含量不得超过

5 n/ 。目前检测残余 C P的方法主要有两 0 g mL S种：相间接血凝法 ( PHA) R A。 R反 R和 I PHA是一

种半定量方法，敏度、定性等均不理想； A灵稳 RI

虽然灵敏、异、确，测定手续繁琐，在放射特准但存收稿日期：0 4 1— 8 2 0—22

性污染，宜推广。所以找一种与国际接轨的、不简

建立检测疫苗中残余牛血清蛋白(CSP)含量的ELISA检测法。将混合的小牛血清分别免疫鸡和家兔,然后分别提取、纯化鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)和兔抗小牛血清抗体IgG。IgY用作包被抗体,IgG用作酶标抗体,四甲基联苯胺(TMB)显色检测残余CSP含量。

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L b ldI a ee mmu o sa

s& C i e J n 0 5,Vo. 2 No 2 n a sy l M d。 u e2 0 n 11, .

便、特异、敏和准确的检测生物制品中残余 C P灵 S含量的方法势在必行。通过一系列试验，文初步本建立了 E S双抗体夹心法检测生物制品中残余 LI AC P的含量。 S 材料和方法

HRP IG,, O L孑， 3℃孵育 1。 P S—g 1 /L O 7 h B- Twe n 0洗涤，入 TMB显色， O L孔，温放 e2加 10/室置 1一5 n O 1 mi。最后加入 2 lL H。 O mo/ S终止反应，

I 0 ./ L 4 0 m测定 A值，空白对照的 A值 O￣:,5 n Lf以校零。以 C P标准的蛋白含量为横坐标，值 ( S A两

孔均值 )纵坐标，制标准曲线。用交叉方阵滴为绘定 I的方法来确定 E I A实验的最佳条件。 3 LS结果

1材料

1 1小牛血清小牛血清分别购自上海天达 .生物工程有限公司 (号 9 1 0 )杭州四季青生批 5 28、物工程材料有限公司 (号 9 0 2 )云南邓川奶批 355和粉厂 (号 9— )批 24。 1 2C P标准品购自中国药品生物制品检 . S定所，号为 20 0。批 0 2 5

1试验条件的确定

经交叉方阵滴定，卵黄 I Y最终包被浓度为鸡 g 2—0 g mL,被体积为 1 0/。 HRP标记，3￣/ 5包 O L孔抗体的最适稀释度为 1 2 0—: 0 0:0 0 1 3 0。最适封闭条

1 3仪器和试剂辣根过氧化物酶 ( . HRP)、 TMB购自 Sg ima公司；标板为 F n a d L b 酶 iln a— s se产品； i—a d l 5 y tms B o rd Mo e 4 0酶标仪为美国产 品； r tiA/亲和层析柱购自 P E E公司； P o en G I RC其它试剂均为国产分析纯。2方法

件： 0 0 mo/ BS p . )制的 0 4明胶。以 . 1 lL P ( H7 4配 . 加样品、 HR标抗体的温度和时间皆为 3℃加 P 71 h。