土壤微生物的分离纯化与鉴定

山东大学微生物学实验报告

微生物学实验报告

题目：土壤微生物的分离纯化与鉴定

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一、目的要求

1． 通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。

2． 掌握常用的微生物鉴定方法，复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。

3． 掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。

二、基本原理

1． 培养基的配制与灭菌。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。

此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。

2． 微生物的分离与纯化。

自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。本实验将采用平板划线分离法。

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3． 分离菌株的鉴定。

微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。

各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。

细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。

三、实验器材

1． 菌种：

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

2． 培养基：

牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。

3． 溶液和试剂：

50%乙醇，20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂，5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。

4． 土样：

于山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表10cm下取得土样。

5． 仪器和其他用品：

普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试

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管，U型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。

四、操作步骤

1． 培养基的制备与分装。

（1）称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。

（2）熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。

（3）调pH ：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH至培养基所需pH。

（4）分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾

上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。

（5）加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界

微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。

2．无菌水的制备。

（1）用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。

（2）用10ml吸管取9ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。

3．器皿的准备。

（1）培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸或牛皮纸包扎（或放在特制铁皮圆

筒里，加盖扣严）。

（2）吸管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。

（3）玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。

（4）枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。

4．高压灭菌。

（1）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一

般121℃，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113 ℃，30min灭菌）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

（2）灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度

的一半为宜。培养基冷至50℃左右，倒平板。

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5．微生物的分离与纯化。

（1） 制备土壤稀释液：称取10g土壤，放入灭好菌的无菌水中用玻璃珠打碎土

壤，放置30min以上。然后取10mL土壤原液于1支试管中，再从该试管中取1mL浸液于装有9mL无菌水的试管中，依次操作，分别将土壤浸液稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍，将7支试管按稀释倍数分别记作0，-1，-2，-3，-4，-5，-6号试管。

（2） 涂布平板：分别取各稀释度试管中0.2mL浸液于准备好的细菌培养基平板

上，用刮刀分别涂布。再分别取各稀释度试管中0.2mL浸液于准备好的霉菌培养基平板上，用刮刀分别涂布。每个稀释度的浸液涂布3个平板。

（3） 培养：将细菌培养基平板置于37℃恒温箱培养24h，将霉菌培养基平板置

于27℃恒温箱培养3d。

（4） 平板计数及菌落描述：将培养好的细菌进行平板计数，计算1g土壤中细

菌数；并观察其菌落形态特征，记录结果。

（5） 平板划线分离：分别将培养好的细菌、霉菌进行平板划线分离。分别在适

宜温度培养。

（6） 菌种保藏（留作鉴定）：将分离得到的菌种进行斜面保藏。每株菌保存3

支斜面。

6． 分离菌株的鉴定。

（1）记录菌种的培养特征。

（2） 细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。

<1>制片：制片方法与简单染色相同。

<2>初染：加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色1.5min，水洗。

<3>媒染：碘液媒染1min，水洗。

<4>脱色：连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。

<5>复染：滴加番红复染1.5min，水洗。

<6>镜检：干燥后，油镜镜检观察。

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