22第二十二章 常用分子生物学技术的原理及应用

第二十二章常用分子生物学技 术的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application

第

一Technology

节

分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting

一、分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 利用DNA变性与复性这一基本性质来进行 变性与复性这一基本性质来进行 利用 DNA或RNA定性或定量分析的一种技术。 或 定性或定量分析的一种技术。 定性或定量分析的一种技术

分子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性(见第二章) 分子杂交特性(见第二章)印迹技术(blotting) 印迹技术(blotting)复性过程中， 在DNA复性过程中，如果把不同 复性过程中 如果把不同DNA单链分子放在同一溶液 单链分子放在同一溶液 与 放在一起，只要在 或 的单链 中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链 或把 放在一起 分子之间有一定的碱基配对关系， 碱基配对关系 分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间 形成杂化双链 杂化双链(heteroduplex) 。 形成杂化双链

分子杂交实验过程 分子杂交实验过程DNA限制酶( 限制酶(HindⅢ)消化 ( Ⅲ )消化 Ⅲ )消化

放射自显影 胶片感光放 放 射 射 自 自 显 显 影 影 照 照 片 片

复性后DNA双链 双链 复性后

复性DNA RNA DNA-RNA杂化双链 杂化双链

琼脂糖凝胶电泳

32P-DNA探针 探针

探针 杂交

滤纸 凝胶 转移缓冲液

加重量 吸潮纸

硝酸纤维素膜 滤纸

变性后DNA单链和 单链和RNA单链 变性后 单链和 单链

转移

印迹技术 探针技术

定义 将在凝胶中分离的生物大 分子转移(印迹) 分子转移(印迹)或直接放在 固定化介质上并加以检测分析 的技术。 的技术。

探针技术探针 (probe) 指经过特殊标记的(已知序列的) 指经过特殊标记的(已知序列的)核酸片段 ； 具有与待测核酸片段互补结合的特定序列； 具有与待测核酸片段互补结合的特定序列； 可以用于检测核酸样品中的特定基因。 可以用于检测核酸样品中的特定基因。 核酸探针的来源或种类 人工合成的寡核苷酸片段 克隆的基因组DNA 克隆的基因组 cDNA 全长或者部分片段 RNA片段 片段 探针标记物 放射性核素 生物素 荧光染料 标记探针的序列如果和NC膜上的核酸序列互补， 就可 膜上的核酸序列互补， 标记探针的序列如果和 膜上的核酸序列互补 以结合到膜上的相应DNA或RNA 区带 ， 经放射自显影或 以结合到膜上的相应 或 其他手段检测就可以判定膜上是否由于探针互补的核酸分 子存在。 子存在。

第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction(PCR) Reaction(PCR)

一种可以将目的微量的DNA片断扩

增 万倍以上的技术 片断扩增100万倍以上的技术 一种可以将目的微量的 片断扩增

Mullis (1993)

染色体PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大

百万倍

一、基本工作原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一 以拟扩增的DNA分子为模板，以一 对分别与模板3 对分别与模板3’和5’端相互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的 作用下，按照半保留复制的机制延 模板链延伸直至完成新的DNA合成。 模板链延伸直至完成新的DNA合成。 重复这一过程，可使目的DNA片段 重复这一过程，可使目的DNA片段 得以扩增。

(一)PCR体系基本组成成分 体系基本组成成分模板DNA 模板DNA

模板DNA 模板

待扩增片段DNA样品 样品

基因组DNA 基因组

特异性引物 一对分别与待扩增DNA序列两端互 一对分别与待扩增 序列两端互 补的寡核苷酸片段。 补的寡核苷酸片段。 耐热DNA聚合酶 聚合酶 耐热 Tag DNA聚合酶 聚合酶 dNTPs 含Mg2+的缓冲液

三个步骤为一个循环， 三个步骤为一个循环， 每次循环产物作为下一 轮模板进入下一轮循环

(二)PCR基本反应步骤 基本反应步骤变性

使模板DNA完全变性成单链。 完全变性成单链。 使模板 完全变性成单链 同时引物自身和引物之间存在 的局部双链得以消除

此温度下DNA 此温度下 聚合酶以dNTP 聚合酶以 为底物催化 DNA链的延长 链的延长

95 C循环 25~30 次

使引物和模板 DNA退火结合 退火结合

延伸 72 C

退火Tm-5 C

5/ 5/

引物A 引物 引物B 引物

第一轮循环

变性( ℃ 变性(95℃) 退火( ℃ 退火(60℃) 延伸( ℃ 延伸(72℃)

℃DNADNA-Pol

5/

5/ 3/

3/ 5/

5/

95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30

DNADNA-Pol

温度

5/ 5/

引物A 引物 引物B 引物

第二轮循环DNA-Pol

变性( ℃ 变性(95℃) 退火(60℃) 退火( ℃ 延伸( ℃ 延伸(72℃) 5/ 5/

℃

5/5/DNA-Pol

3

DNA-Pol

5/

3/

5/ 5/

5DNA-Pol

95 / 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 / 30

温度

第三次循环DNA-Pol

变性( ℃ 变性(95℃) 退火(60℃) 退火( ℃ 延伸( ℃ 延伸(72℃)DNA-Pol

℃5/95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30

5/DNA-Pol

5/

5/DNA-Pol

DNA-Pol

DNA-Pol

5/DNA-Pol

5/

5/DNA-Pol

5/

温度

3/

5/

5/ 3/

DNA样品 样品

引物A 引物 引物B 引物

待扩增序列

基因组DNA 基因组 3/5/

5/ 第一次循环

3/

第二次循环

第三次循环

第四次循环

四、PCR的主要用途 的主要用途 1、与反转录结合， 利用PCR技术可以随直接从组织细胞中 意设计引物在体外对 的mRNA 获得目的 目的DNA的基因片段 基因； 进行嵌和、缺失、点 目的基因 基因的 2、利用特异性引 突变等改造。 的克隆 物以cDNA或基因 体外突变

组DNA为模板获得 目的基因片段； 利用PCR结合其它技 3 3、利用简并引物 术，可以提高基因突 PCR的 的 从cDNA 文库或基 变检测的敏感性。 因组文库中获得具 用途 基因突变 DNA 有一定序列相似性 分析 序列测定 的基因片段； 4、利用随机引物 从cDNA文库中克 PCR技术高度敏感，对 DNA和RNA 和 隆基因。 DNA的含量要求很低。理 的微量分析 论上只要存在一分子的模 板就可以获得目的片段。 RNA需要反转录。

三、几种重要的PCR衍生技术 几种重要的PCR衍生技术反转录PCR技术 反转录 技术 Reverse transcription PCR , RT-PCR

(一)反转录PCR技术 反转录PCR技术

将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用 的一种技术。反转录 PCR

RNA

cDNA PCR的模板 的模板

扩增的目的基因

RT-PCR是目前从从组织或细胞中获得目的基因以及对已 是目前从从组织或细胞中获得目的基因以及对已 知序列的RNA进行定性与定量分析的最有效方法之一。 进行定性与定量分析的最有效方法之一。 知序列的 进行定性与定量分析的最有效方法之一优点：敏感度高、特异性强、省时。 缺点：对样品中原有mRNA含量判断不准确

原位PCR PCR技术 原位PCR技术 In situ PCR ,ISP

(二)原位PCR技术 原位PCR技术

原位PCR是将 原位 是将PCR技术与原位杂交技术相 技术与原位杂交技术相 是将 结合的一项新技术。 结合的一项新技术。– 在福尔马林或石蜡包埋的组织切片或细胞涂片 上的单个细胞内进行的PCR反 …… 此处隐藏：3261字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……