纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用——武汉大

武汉大学综合化学实验实验报告

纤维素柱填料的制备及其在 超氧化物歧化酶提纯中的应用

（武汉大学化学与分子科学学院，武汉 430072）

摘要：为制备一种成本较低、具有很高分辨性能和良好物理性能的新型尺寸排除色谱，并通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机试剂沉淀蛋白质以及梯度洗脱柱层析方法。将猪血中的超氧化物歧化酶SOD提纯出来，并采用聚乙二醇-2000（PEG—2000）和纤维素铜氨溶液共混的方法，通过柱层析（即尺寸排阻色谱）达到酶的分级。

关键字：超氧化物歧化酶、纤维素填料、尺寸排阻色谱、梯度洗脱 中图分类号：O 643文献标识码：A

0 引言

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，缩写为SOD）广泛存在于各类生物体内。按其所含金属离子的不同分为3 种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu.Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能专一性的清除超氧化物阴离子自由基O2而保护细胞，能治疗多种炎症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，对生物体有保护作用。在猪血液里，Cu.Zn-SOD 与血红蛋白等共存于红血球。通过一系列操作可从猪血中提取Cu.Zn-SOD，并通过DE-32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。

1 实验部分[1]

1.1 试剂与仪器 （1）试剂

CuSO4.5H2O, 20%NaOH, PEG—2000, 棉短绒，4%硫酸，异丙醇，浓氨水，95%

乙醇，氯仿，K2HPO4.3H2O ,K2HPO4, 0.9%NaCl, 丙酮，10mmol/L HCl，新鲜猪血500mL，2.5%草酸钾，甲醛溶液。 （2）仪器

烧杯，量筒，1000mL分液漏斗，药匙，洗瓶，抽滤装置，玻璃搅拌棒，淋洗液瓶，电磁搅拌器，玻璃色谱柱，试管，台秤，机械水泵,电炉，注射器及针头，回收瓶（Cu(OH)2），紫外分光光度计（UV-1601 岛

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津），低温高速离心机。 1.2 实验步骤

1．酶的制备

（1）取新鲜猪血500 mL（已予先加入50 mL 2.5%草酸钾作为抗凝剂），3000转/min 离心20 min 除去上层血浆，收集红细胞约250 mL，加入等体积的0.9%NaCl溶液，用玻璃棒搅拌充分洗涤，3000转/min 离心20min，弃去上清液（如此反复 3 次），收集洗净的红细胞放入800 mL 烧杯中，加250 mL 重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40 min以上，得溶血液500 mL。

（2）往溶血液中缓慢加入在4℃下预冷过的95%的乙醇125 mL（0.25 倍体积），然后再缓缓加入在4℃下预冷过的氯仿75 mL（0.15 倍体积），搅拌15 min，室温下3000转/min 离心20 min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液约330 mL（留样，为酶1），此即酶的粗提液。

（3）往上述液中加入K2HPO4·3H2O130 g，转移到分液漏斗，振荡后静置分层（约15min）。收集上层乙醇-氯仿相（微浑浊），室温下离心（3500转/min）25min，弃去沉淀，得上清夜约100mL(留样为酶2)。

（4）向上一步所得上清夜加入0.75 倍体积在4oC 下预冷过的丙酮，Cu·Zn-SOD便沉淀下来。室温下3500rpm离心20min ,收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5mL 重蒸水中（呈悬浮状，留样为酶3），在4℃下，在250mL 200 mmolL-1pH7.6 的磷酸钾缓冲液中透析，每隔0.5h 换透析液一次，共换4 次。透析内液出现沉淀，在室温下3500转/min离心，弃去沉淀，收集上清液7 mL（留样，为酶4）。

2. 纤维素柱填料的制备 （1）制备Cu(OH)2

16.50gCuSO4.5H2O 加132mLH2O，搅拌加热至沸后，缓缓加入8mL 25-28 0/0 的浓氨水，并搅拌。冷却至室温后，用水将沉淀洗至中性。倒出清液后，加112mL H2O入沉淀中，冰水浴条件下加入53mL 20%NaOH溶液并搅拌，草绿色变为天蓝色，再用水洗至中性，抽滤得天蓝色湿Cu(OH)2（含水率约60%）。

（2）制备纤维素铜氨溶液

7.60g 纤维素置于47.5g（53mL）浓氨水中，加入13mL 水后密封杯口置于冰箱中冷至10℃以下。将10.4g 含水率约60%的Cu(OH)2 加入到6.4g（6mL）10%NaOH 里，搅拌均匀后倒入上述冷却的纤维素氨水溶液中，立即搅拌均匀置于冰箱。冷却后加13mL 水，继续搅拌，再冷却，再搅拌直至变为兰色清亮的粘稠溶液（Ⅰ）。纤维素浓度为8%，溶液总重量约96.43g。

（3）柱填料的制备

将8.03gPEG-2000 溶于40mL 水，制成20%PEG 水溶液（Ⅱ）。要求溶液（Ⅰ）为蓝色透明粘稠液体，溶液（Ⅱ）应为白色透明粘稠液体。各取（Ⅰ）和（Ⅱ）40mL，搅拌下混合均匀，得共混液（Ⅲ）。

将共混液（Ⅲ）装入注射器中，注射器前端套上黄色枪头，均匀用力推出呈丝状的溶液，直接在10%的NaOH溶液中凝固15min。然后将所得的丝状物转移到4%的稀硫酸溶液中，放置30min，可以得到透明而

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均匀的细丝。用水洗去酸，再把细丝切成长为1mm 以下的圆柱体，放在70℃的水中加热约1h，以除去其中的PEG-2000。此圆柱体为SEC 柱1#填料。

同上法，不用共混液，而直接用纤维素铜氨液（Ⅰ）可制得SEC 柱2#填料。 3. 酶的纯化和活性测定

（1）纤维素柱层析：将实验1 所得柱填料1#和2#按体积比1:1 混合并填充玻璃色谱柱，柱体1.5×20cm，填装时不要混入气泡，同时轻轻敲打管壁，使填料填充紧密，均匀。装好后，填料的上部用一小团棉花覆盖，以保持胶床顶部平整，不受流入溶剂干扰。用2.5 mmol/LpH7.6 缓冲溶液作平衡液，用2.5mmolL-1(100mL)-200mmolL-1(100mL)pH7.6 的磷酸钾缓冲溶液.

按图1搭建梯度洗脱装置进行梯度洗脱。流速为40mLh-1，每管收集4mL，收约20管。以H2O为参比，在280nm处采用紫外吸收法测定每管的吸光度，绘制淋洗曲线。

图1. 梯度洗脱装置图

（2）邻苯三酚自氧化速率的测定

在试管中按照表1加入缓冲液，于25 ℃保温20 min，然后加入预热的邻苯三酚（对照管用10 mmol/L HCl代替），迅速摇匀，导入1 cm比色皿中，在327 nm处，每隔30 s测吸光度一次。

表1. 测定邻苯三酚自氧化速率试剂用量表 试剂

50 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl缓冲液

45 mmol/L邻苯三酚

加入量（mL）

4.5 0.01

最终浓度（mmol/L）

50 0.1

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总量 4.5 /

（3）SOD或粗酶提取液的活性测定 按照表2加样，测定方法同上

表2.测定SOD及粗酶活性的试剂用量表 试剂

50 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl缓冲液

45 mmol/L 邻苯三酚

SOD或粗酶 总量

加入量（mL）

4.5 0.01 0.01 0.01

最终浓度（mmol/L）

50 0.1 / /

2结果与讨论

2.1 实验结果

表3.邻苯三酚的自氧化速率与酶活性测定结果

编号 1 1’ 2 2’ 3 3’ 4 4’ 5 5’

50 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl缓冲液

4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL

10 mmol/L HCl

10 μL / 10 μL / 10 μL / 10 μL / / 10 μL

45 mmol/L 邻苯三酚

/ 10 μL / 10 μL / 10 μL / 10 μL / 10 μL

10μL酶 不加 不加 酶 1 酶 1 酶 2 酶2 酶 3 酶 3 酶 4 酶 4

斜率 0.0950 0.0420 0.0254 0.0093 0.0059 0.0327（稀释后）

单位体积活力（U/mL）= [（0.07-样液速率）/0.070/50% ]*100 %

*反应液总体积*（样液稀释倍数/样液体积） 总活力（U）=单位体积活力（U/mL）*原液总体积

按上面两式，根据斜率计算酶活 …… 此处隐藏：5475字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……