Tra-dUTP使用说明书

高亲和力适体筛选方法

Tra-dUTP使用说明书

高亲和力核酸适体筛选方法

杭州耀洲生物科技有限公司

高亲和力适体筛选方法

目录

1.产品介绍.......................................................................................12.产品组成.......................................................................................23.使用方法.......................................................................................34.注意事项.......................................................................................45.附录一Tra-dUTP制备高亲和力的核酸适体操作方法...........5

高亲和力适体筛选方法

1.产品介绍：

Tra-dUTP（[N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]amino]-5-carboxamide-2'-Deoxyuridine-5'-triphosphate,中文:5-（N-(2-(3-吲哚基）乙基）甲酰胺基）-尿嘧啶脱氧核苷酸）是一种经色胺修饰后的5’甲酰脱氧核苷三磷酸，是杭州耀洲生物科技有限公司开发的用于制备高亲和力核酸适体的专用试剂。

核酸适体是指一类能够特异性地结合离子、分子,甚至整个细胞的单链DNA或者RNA分子，通常它通过一种称为Selex的体外筛选方法制备。目前普通Selex方法制备的核酸适体与蛋白的亲和力低，不能满足应用需求，因此实用性的适体产品很少。

2010年12月，核酸适体先驱LarryGold首先报道了应用Tra-dUTP化合物，在其筛选的几十种血液蛋白中，均得到了Kd为10-9～10-12高亲和活性的适体。由于Tra-dUTP是甲酰基团和吲哚结构修饰的嘧啶碱基，引入的甲酰基团和吲哚结构是增强分子间作用的基础，能够极大地提高核酸与靶向分子的结合能力；而使用非修饰碱基，普通条件下得到的适体活性在一般10-6左右。因此使用Tra-dUTP试剂提高了产生高亲和力适体的几率，可有效缩短适体研究的周期，降低研发成本。

耀洲生物成功地开发了Tra-dUTP系列试剂，能够满足不同适体研发目的，得到具有实用价值的高亲和力核酸适体。

高亲和力适体筛选方法

2.产品组成：

耀洲生物提供相关的产品有Tra-dUTP冻干粉（NT3102），Tra-dUTP与dATP\CTP\GTP的混合溶液（NT0991），以及其他配套试剂，可用于高亲和核酸适体的筛选。

产品编号NT3102NT0991NT0519NT0517NT0515NT0513

产品组成

Tra-dUTP

Tra-dUTP，dATP，dCTP，dGTP（10mMeach）

dTTP（20mM）dATP，dCTP，dGTP（20mMeach）dATP，dCTP，dGTP，dTTP

（2mMeach）10X结合/洗涤缓冲溶液

规格1mg

（1.55umol)100ul100ul100ul1ml5ml

反应体系反应次数

50ul100次

50ul200次

注：试剂中其他碱基均为进口产品，按附录一“Tra-dUTP制备高亲和力的核酸适体操作方法”制备的适体，其序列中tra-U完全替代了碱基T。如您需要制备不完全替代的高亲和核酸适体，可以将dTTP与Tra-dUTP（NT3102）以不同比例混合，但此条件下在测序时确定Tra-U的位置会有一定难度。如有疑问欢迎来电咨询。

所有产品均应置-20℃冷冻保存。NT3102为冻干粉，可自行配制所需浓度。

NT0991为Tra-dUTP和dATP，dCTP，dGTP混合物，碱基浓度均为10mM。可直接用于引物延伸反应。

NT0519为单一的dTTP浓度20mM溶液100ul，NT0517为dATP，dCTP，dGTP浓度各为20mM的混合溶液100ul，如有需要两者可以和Tra-dUTP（NT3102）一起配制不同浓度的引物延伸反应体系。

NT0515为用于biotin核酸产物与avidin琼脂的结合/洗涤缓冲液。

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3.使用方法：

Tra-dUTP是一种特殊的修饰碱基，在DNA复制过程中，可代替dTTP参与反应，其结构和正常的dTTP相差较大，因此不同的PCR酶对其的利用效率不同。常见DNA聚合酶的掺入Tra-dUTP反应速度如下表所示；

不同DNA聚合酶使用tra-dUTP为底物时的引物延伸反应效率

Triphosphate

TTPTta-dUTP

KODXL100%88.00%

Pfu(exo-)100%61.50%

D.Vent(exo-)

100%100%

Tth100%5.80%

Taq100%8.90%

KF(exo-)100%0.70%

Tra-dUTP由于其掺入DNA序列的速度较低，不能直接用于正常的PCR体系循环。我们通过PCR后得到的含生物素的单链DNA，经引物延伸反应，用固相化链亲和素去除含生物素的单链DNA，制备出含有Tra-dUTP的单链DNA，可进行适体靶标结合，筛选出来的高亲和力Tra-U修饰DNA可直接用于PCR扩增。

Tra-U掺入法进行适体筛选的具体流程如下图所示。

Tra-dUTP的详细使用流程见附录一。

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4.注意事项

a.请将产品融化后，轻轻摇匀后使用；

b.Tra-dUTP的掺入效率受DNA聚合酶影响很大，建议使用KOD，Pfu酶进行引物延伸反应；

c.反应液的配制、分装必须使用灭菌后的枪头、离心管等，避免污染；d.试剂保存或配制时应避免强光照射，用完后及时冷冻保存。

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5.附录一

Tra-dUTP制备高亲和力的核酸适体操作方法

材料与试剂：

氢氧化钠，HCl（国药集团化学试剂有限公司，AR）pfuBuffer（Mg2+），pfu(2,5u/ul)（Ferments）dNTP（Sigma-Aldrich，DNTP100-1KT）Tra-dUTP混合核苷酸（NT0091，耀洲生物）

引物P1，biotin修饰引物P1，引物P2，biotin修饰引物P2，随机DNA模板库

Pierce®MonomericAvidinAgarose（Thermoscientific产品编号：20228）10XWashbuffer(100mMNaCl40mMHEPES5mMKCl1mMMgCl0.25%吐温)1.制备正常双链DNA：

随机DNA模板库进行PCR反应，其中引物中P1为biotin标记。

1.1反应液的配制：

PCR反应（50ul）如下配制：

反应液P1（biotin引物）

P2TemplateDNA

dNTP

10X

Pfubuffer（Mg）

无菌水

PfuDNApolymerase

2.5u/ul

2+

起始浓度50uM50uM可以是筛选产物

Each2mM10X

加入体积1ul1ul1ul5ul5ul36ul1ul

终浓度1uM1uM10-100ng0.2mM1X

0.05u/ul

注：您可以根据比例按照自己的需要调整反应体积。1.2PCR反应程序：

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20次热循环

步骤温度时间体系

预变性

变性

94℃5min

94℃30s

退火49℃30s

50ul

延伸72℃60s

72℃8min

4℃30min

延伸

保存

退火温度和延伸反应时间可根据需要调整，以保证获得高质量的PCR产物。

2.制备单链DNA：

本步骤将PCR产生的双链用于制备Tra-U修饰DNA的模板，将双链DNA中加入Monomericavidinagarose，经NaOH溶液洗脱后，将双链DNA变为单链DNA。

（根据Monomericavidinagarose结合biotin的摩尔数，20ul悬浮液可以用于200ulPCR反应产物）。

1.取出20ulMonomericavidinagarose悬浮液，置于0.5ml离心管中；2.加入结合/洗涤缓冲液200ul充分摇匀，1500rpm离心2min，弃去上清液，重复此步骤2次；

3.将含Biotin的PCR产物（100ul-150ul）加入至清洗后的avidinagarose的离心管中，室温振荡10min，让biotinDNA与Monomericavidinagarose充分结合，1500rpm离心2min，小心去上清液；

4.在有DNA结合的Monomericavidinagarose的离心管中，加 …… 此处隐藏：4289字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……