激光共聚焦显微镜

胰腺细胞悬浮液样品 适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为

1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。

Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

方法：

1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic

F-127备用。

2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10 umol/L染料液1 ml，置于37℃的CO2孵箱里避光温育30 min。

3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1 ml DMEM液后置于20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。

4.启动LSCM，选择488 nm 氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp 2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30 sec）、扫描次数（300次），开始扫描。

5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。

1)如果直接做活细胞观察,可以把细胞直接seed在放在6 well中的盖玻片上,然后培养,等观察时用镊子把盖玻片取出,倒扣在载玻片上就行了.

2)需要做免疫荧光染色的,可以做完染色,然后把细胞悬浮起来,滴一滴到载玻片上,盖上玻片观察. 如果是用探针孵育活细胞，可以先做成细胞爬片，在相关处理后，探针避光孵育，完毕后，用镊子把细胞爬片取出,倒扣在载玻片上就行了. 买国产玻片就可以，不过要泡酸过夜后再灭菌，之前可以按自己需要切片，根据大小，然后在30mm培养皿，中间打孔，用泡酸洗好的大玻片粘好，用时细胞种在切片上，切片放在皿小孔中，罐流都可以的。我们实验室十几年这种方法，不过如果活细胞工作站要求皿可以订制，很便宜，细胞可种在大玻片上，这样透光好。1、盖玻片买国产的就可以，不过有时背景较脏。你最好拿弱酸，如稀盐

酸浸泡。

2、然后灭菌，比如紫外照射，两面都照射，然后放于合适的孔板中，接种合适密度的细胞于孔板中，一般较稀一些，那样容易有单个的细胞，得到较好的图片。

3、加抗体时最好能在封口膜上操作，那样很节约抗体，样品可以放到一个湿盒中，饭盒加水就可以了。一定要记住接种细胞的玻片面，别弄反了。

4、在载玻片加上一滴，防淬灭剂，用甘油配制的DABCO，将含细胞的盖玻片那一面朝向载玻片放置，周围再用指甲油或其它胶固定。用锡箔纸报住，避光4c保存，最多一个月。

5、最好染核，核好染，同时也便于观测。

6、先在普通荧光显微镜下观测你的结果，实验理想的话再去看激光共聚焦。毕竟激光共聚焦很贵。我做过confocal，我个人觉得用confocal来看细胞的亚结构非常好。我用的OLYMPUS的FV1000,我看过说明书介绍，confocal可以做离子浓度的测定，但是我没有做过。组织的切片一样可以做confocal,我的一个朋友就是做的组织，方法和做细胞的荧光一样，结果不错。

我当时做的是细胞的免疫荧光，方法和基本的免疫荧光一样，细胞种在载玻片上，60%融合就好，不要长满，因为细胞太多，挤在一起的话，会影响成像。一抗，荧光二抗，依次孵育。我把我毕业论文中的一张图贴上来给大家看看。我做的是双染，一个抗体用的FITC（绿色），是一种微管蛋白；另一个用的是TRITC，是一种结构蛋白。黄色是两种融合的图像，结果发现这两种蛋白结构上共地位。是否要confocal和免疫组化都做要取决于实验的具体检测指标和实验的目的，比如检测核因子等转录因子，静息状态时核因子kb存在于细胞浆，刺激时进入细胞核，这样用激光共聚焦的共定位技术就可以很清楚的指示出来，而免疫组化只能粗略的看出。

组织切片的自发荧光应该是限制了荧光标记技术在这一方面的应用，所以不做任何处理， 在荧光显微镜下都可以看到荧光，处理这样的情况一是选用不同的标记荧光尽量避开自发荧光，也有些去除自发荧光的措施，要具体情况具体使用了。

当然不排除有些文章纯粹为了confocal而confocal，其实能用简单的实验说明问题了就不要选用复杂的了，免疫组化的定位显示在发国外论文的时候还是很受重视的。免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述……………………………………………………

二、免疫荧光组织化学的原理…………………………………………………………………

（一）直接方法……………………………………………………………………………

1． 检查抗原方法……………………………………………………………………

2． 检查抗体方法……………………………………………………………………

（二）间接方法……………………………………………………………………………

1．检查抗体(夹心法)方法……………………………………………………………

2．检查抗体方法 ……………………………………………………………………

3．检查抗原法 ………………………………………………………………………

（三）补体法………………………………………………………………………………

1．直接检查组织内免疫复合物方法………………………………………………

2．间接检查组织内抗原方法………………………………………………………

（四）双重免疫荧光组织化学标记方法…………………………………………………

（五）对照试验……………………………………………………………………………

1． 直接方法 …………………………………………………………………………

2． 间接方法 …………………………………………………………………………

3． 补体方法 …………………………………………………………………………

三、荧光抗体的制备………………………………………………………………………………

（一）荧光素 ………………………………………………………………………………

1． 异硫氰酸荧光素 …………………………………………………………………

2． 四甲基异硫氰酸罗达明 …………………………………………………………

3． 得克萨斯红(Texas red)……………………………………………………………

4．其它荧光素…………………………………………………………………………

（二）荧光素标记抗体的方法 ……………………………………………………………

1．FITC标记抗体的方法……………………………………………………………

2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法………………………………… …… 此处隐藏：17978字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……