SBT 10317-1999 蛋白酶活力测定法_NoRestriction

国标测定蛋白酶活力

备案号： 7419 24-99

中华人民共和国行业标准

蛋白酶活力测定M es rme t poen s atvt au e n o r tiae ii f c y

/ 1 3 -创冲 x 0 1 1 7

替ZB 63 -8 X 600 7

本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。福林法

11 试剂及溶液： .以下试剂都为分析纯 11 福林试剂 (on . . 1 F l试剂}于 2Om磨口回 i: 0O L流装置内，加入钨酸钠. a O - O 1 g ( p,,), NW 2 H 0 0钥酸钠 (a O HO 2g蒸馏水70 L 80 N,, 2,), Mo 5 0m, o 5m, 5磷酸 0 L浓盐酸 1 m, 0 L文火回 lh取 0流 o。去冷凝器，加入硫酸铿 (i0)蒸馏水 5 L混匀， L 45多馆， 0, m加人几滴液体澳，再煮沸 1 i以驱逐 5n m,残澳及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴澳液，再煮沸除去之。冷却定容至 1 0 L用细菌漏斗〔o^过滤，后， 0m, 0 N4 5 )置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加 2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 11 04碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠 ( aC 2 . l . . mo N,OO 24,定容至 10mL, 4.8 00

113 m l 04 o三氯乙 (C )溶液： . . .酸 TA称取三氯乙 (C, O ) 4,酸 C LC H 6 g定容至 10m, O 5 . 00L 11 p 7磷酸盐缓冲液： 2 .. H . 4称取磷酸二氢钠 (a 2 4 2,)跄， NHP 10 3.定容至 1 0 L即成 O 4 1 0m, 0 02 o溶液 ( . l m A液)称取磷酸氢二钠 (a P, 1HO 7.3,。 N, O 2}) 6g定容至 1 0 L即成 02 o溶 H 1 0m, 0 . l m液 ( B液) .取 A液 2m 8 L和 B液 7m 2 L,再用蒸馏水稀释 1,即成 0l l 72倍 . p . mo H的磷酸盐缓冲液 .

1. %蛋溶准称干素第，准 . .入0 N氢化 l在浴 . 5酪白液：确取酪 1 2称至0 0加 .氧钠 OL水中 08 2 1 m加热使溶解 (必要时用小火加热煮沸)然后用 p 72, H .磷酸盐缓冲液定容至 l L即成。 Om O配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质.

116

p/ L 10gm酪氨酸溶液： . 0 .精确称取在 15 0℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸。10逐步加入 .0馆， 6 LN盐酸使溶解， 02 rl a用 . N盐酸定容至 J m, O L其浓度为 1 0gm, O 0 p/ L再吸取此液 l, . 0 O L 2 m以0 N盐酸定容至10 L即配成 10gm酩氨酸溶液。 0, m 0p/ L的此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。 12 仪器 . a分析天平 :感量 0l g . .; m

b51 . G型光电比色 8-计或 7型 2分光光度计； c水浴锅； .d 1 2, mL移液管等。 5 10 .,, 013 操作 .

国欢国内局1 90 1搜易 9 - -批准 9 4523 0

990-5实施 9-41

国标测定蛋白酶活力

S 1 1 71 B1璐1-创冷

13 1标准曲线的绘制 .. 13 11按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ( 1, .-.表 )表 1配制各种不同浓度的酪氮酸溶液 管号4 5 6

试

剂1 2 3

蒸馏水 .. L 10gm 0p/ L酪氨酸，mL

1 0 0 0

8 2 2 0

6 4 40

4 6 6 0

2 8 8 0

0 1 0 10 0

酪氨酸最终浓度，/ L pm g

13 . 1测定步骤： 6 .. 2取支试管编号按表 1分别吸取不同浓度酪氨酸 1L各加入 04 o碳酸钠 m, . 1 m 5 L再各加人已 m,稀释的福林试剂 1 L摇匀 m。置于水浴锅中。0 4℃保温发色2mn 8- 0 i在51 G型光电比色计上分别测定光密度 ( D)( O滤色片用 6" 5 )或用 7型分光光度计进行测定 ( 2波长 60m)一般测 6n。三次，取平均值。 1-号管所测得的光密度 ( D将^6 O )减去 1号管 (蒸馏水空白试验 )所测得的光密度

为净O D数。为了清楚起见，再列出表格如下 ( 2, 表 )

表 2 管试剂1 2 1 5 1 3 1 5 1 4 1 5 1 5 1 5 1 6 1 5 1

号

按表 1制备的不同浓度酪氨酸，mL0 4 1L 2 ./ NaC0 mo mL

1 5

福林试剂，mL

’1 2

1

O D值3

平均净 OD值0

以净 OD值 为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线 (或可求出每度 O D所相当的酪氨酸量 K),

1.

样品稀释液的制备。 .2 3 1- 1 .测定酶制剂： .2 3称取酶粉。10, .0g加入p 72 H .磷酸盐缓冲液定容至 10 L吸 0m,取此液 5 L m,再用缓冲液稀释至 2m 5 L,即成 50倍的酶粉稀释液。 00

1. 2 .测定成曲酶： .2 3称取充分研细的成曲5, g加水至 10 L在 4℃ 0m, 0水浴内间断搅拌 l, h过滤，滤液用 0lo H72盐缓冲液稀释到一定倍数 ( . l . m p磷酸估计酶活力而定)。 133 样品测定： 1X m ..取 5 0。试管 3编号 1 2 3( 2也可)每管内加入样品稀释 1 0支，,,做只，掖1 mL,置于 4℃水浴中预热 2 n再各加入经同样预热的酪蛋白 1,精确保温 l n 0 mi, mL O i,时间到后， m立即再各加入 04 o三氯乙酸 2 L, . l m m以终止反应，继续置于水浴中保温 2mi, 0 n使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取 1X 0 m试管 3,编号 l 2 3 5 5m 1支，,每管内加入滤液 1,再加。4 l, mL .碳 mo

酸钠 5 L m,已稀释的福林试剂 1 L m摇匀， 0保温发色 2mn 4℃ 0 i后进行光密 (D度 O )测定。

2 31

国标测定蛋白酶活力

SB/ 1 3 7 1 1 T 0 1 - 8均

空白试验也取试管 3支， 编号 () () () 1,,,测定方法同上，在加酪蛋白之前先加 04 l 2 3唯 .三 mo氯乙酸 2 mL,使酶失活，再加入酷蛋白。为了清楚起见，分别列出表格于下 ( 见表 3及表 4, )管试剂1 2 1 1 3 1 1 1 1

表 3 号试剂() 1

管

号() 21 2 ( ) 3 1 2

预热酶液，mL预热 2%酪蛋白，mL作用 1mi ( 0 n精确计时) 04 o三抓乙酸，mL . 1 m

预热酶液，mL。4 1 .m.三氯乙酸，mL作用 l n (确计时) Oi精 m

1 2

2

2

2

预热 2写酪蛋白，.L

1

1

1

表 4管试剂1 2 1 5 1 3 1 5 1

号() 11 5 1

() 21 5 1

() 3 1 5 1

滤液 ..L 0 4 1 2 . mo NaCO3 mL,

I 5 1

福林试剂，mL OD值平均 OD值净 OD值

0

样品的平均光密度 ( )一空白的平均光密度 ( D二净 OD值。 OD O )

14计算 .在4 ℃下每分钟水解酪蛋白

产生 lg氨酸，定义为 1 0 u酪个蛋白酶活力单位。

砰而重曰附沽刀单仅 l十量)= X IX下； ...........以； 4 . X -玉..................少 . V于....... .......... ........式中：A —由样品测得 O D值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数 ( O或 D值 XK); 4 1 L测定 ( 4 ) - 4毫升反应液取出 m即倍；

.、, _,￣、 _,

‘,_,。、、 _

A

_

1

IU 工— 1 1

N -酶液稀释的倍数； 1—反应 1mn 0 0 i;W—样品水分百分含量。

15 注意事项 .以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶 (H72。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶， p . )则把配制酷蛋白溶液和稀释酶液用的 p H缓冲液换成相应 p缓冲掖即可。现把几种常用 p H H缓冲液配方提供如下： 15 , p . .. H75磷酸盐缓冲液 (. 1L 00mo/ ) 2称取磷酸氢二钠 ( aH 0, 2 2 60g和磷酸二氢钠 ( a P H2 05 N 2P 1H 0) 2 . N H2O, 2 0) g以蒸馏水溶 .2 32

国标测定蛋白酶活力

SB胭

1 97 8 0 1-168

解定容至 10m e 00 L15 . 2 H25 .. p乳酸一乳酸钠缓冲液 (. l 0 0mo) 5

A液： 8% 0称取 0一9%乳酸 1.加蒸馏水稀释定容至 10m o 06, g 00 L B液： 7肠称取 0乳酸钠 …… 此处隐藏：3975字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……