噬菌体展示技术在靶向性细胞膜穿透肽鉴定中的应用_孙丽莎

噬菌体展示技术在靶向性细胞膜穿透肽鉴定中的应用

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专题综述

ＲEVIEWAＲTICLES

生物技术2014年24（5）

噬菌体展示技术在靶向性细胞膜穿透肽鉴定中的应用

孙丽莎，柳长柏

*

（三峡大学分子生物学研究所，湖北宜昌443002）

摘要：噬菌体展示（Phagedisplay）是将外源蛋白质或多肽展示在噬菌体表面，而对应的编码基因整合在噬菌体基因组中的一项用来筛选特定蛋白质或多肽的技术。这一技术实现了基因型与表型的一一对应，使得特定外源蛋白或多肽及其编码基因的筛选简便易行。噬菌体展示技术作为一种新的淘选工具，在鉴定特异性蛋白、多肽，特别是新型细胞膜穿透肽应用中显现出广阔的应用前景，为鉴定新型靶向递药载体、实现药物的靶向投递奠定了基础。该文概述了噬菌体表达载体的分类以及淘选过程，利用噬菌体展示技术淘选新型细胞膜穿透肽的应用及其研究进展。

关键词：噬菌体展示技术；生物淘选；靶向投递；细胞膜穿透肽

中图分类号：Q782；T201203

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1004－311X．2014．05．0123－4

IdentificationofHomingCellPenetratingPeptidesbyPhageDisplayTechnology

SUNLi－sha，LIUChang－bai*

（InstituteofMolecularBiology，ChinaThreeGorgesUniversity，Yichang443002，China）

Abstract：Phagedisplaytechnologywasapowerfultoolforidentificationofcelltargetingpeptide.Proteinorpeptidesvariantsareexpressedontheoutsideofphagevirion，whilethegeneticmaterialencodingeachvariantprotein（peptide）sequenceswereinsertedinthephagegenome.Asanewkindofbio－panningtool，phagedisplaytechnologywasanovelcandidatetoidentifyhomingcellpenetratingpeptidefortargeteddrugdelivery.Inthisreview，thephagevectorclassificationandselectionprocessweresummarized.Andthemethodsforidentifi-cationofhomingcellpenetratingpeptidesbyphagedisplaytechnologyandtheprospectforfurtherapplicationweremainlyintroduced.Keywords：Phagedisplaytechnology；Bio－panning；Cell－penetratingpeptides；Targeteddelivery

0引言

噬菌体展示技术由GeorgePSmith

［1］

1

于1985年首次提出，

噬菌体展示技术

噬菌体是一类寄生于细菌的病毒，具有严格宿主特异性，

［5］

该技术利用基因工程方法将大量编码不同短肽、蛋白质或抗体片段的基因定点插入到编码噬菌体主要外壳蛋白（PⅧ）的gVⅢ或次要外壳蛋白（PⅢ）的gⅢ基因序列中，融合的外源蛋白质表达在PⅧ或PⅢ的N端，噬菌体颗粒表面表达的外源蛋白质或多肽片段具有独立的空间构象，易于被特异性受体分子识别、结合。基因型与表型的一一对应，有利于鉴定特异性外源蛋白或多肽的编码基因。细胞膜穿透肽（Cell－penetrat-ingpeptides，CPPs）是一类具有穿透细胞膜能力的短肽，可有效介导包括治疗性药物在内的多种活性物质、纳米颗粒跨膜进入细胞，是一种极具应用前景的药物跨膜递送载体。目前关于CPP的穿膜机制报道众多，但仍无定论

［2－4］

它的基因数目少，结构简单，易于操作。噬菌体展示技术是

通过在噬菌体颗粒表面展示蛋白或肽库，基以识别、结合相应配体而实现筛选特异性蛋白、多肽或抗体片段的一种新型展示技术。目前使用最为广泛的是丝状噬菌体展示，主要是运用噬菌体载体（Phagevector）和噬菌粒载体（Phagemidvector）进行蛋白（肽）库编码基因的插入和构建，继而包装形成表达外源蛋白（肽）的噬菌体库。1.1

噬菌体载体

噬菌体载体主要为M13丝状噬菌体，它可侵染F+大肠杆菌。噬菌体进入宿主菌后，依靠宿主的复制系统将自身单链DNA转变成双链环状，再通过滚环复制的方式产生单链DNA。在穿过内膜时单链噬菌体DNA被包装，最后以成熟噬菌体颗粒形式被释放。成熟的噬菌体以分泌的形式进行增殖，不会导致宿主菌的裂解。1.2

噬菌粒载体

噬菌粒载体有较高的转化率，可以用来筛选亲和力高的

。研究人员

期望借助噬菌体展示技术寻找新的靶向性CPP，以实现治疗药物的靶向投递。本文将综述利用噬菌体展示技术鉴定新型CPP的方法、应用及其研究进展，为进一步靶向跨膜载体开发、研究提供参考。

收稿日期：2014－05－16；修回日期：2014－08－14

基金项目：2012－2015年湖北省高等学校优秀中青年创新团队计划项

，No．目（“SiＲNA介导的Gremlin1表达抑制对肝纤维化形成的影响”

81070348）；国家自然科学基金面上项目（“运用mＲNA展示技术建立

，No．2010CDB10705）；2010年湖北省科技计细胞膜穿透肽筛选平台”

划自然科学基金一般项目资助作者简介：孙丽莎（1990－），硕士研究生，研究方向：女，河北成安人，

Email：Sun754602338@126．com；*通讯作生物化学与分子生物学，，，：（1962－）教授，硕士生导师，研究方向：药男湖北孝感人，者柳长柏

Email：cbliu@ctgu．edu．cn。物的跨膜运输、生物治疗，

展示肽。敲除噬菌粒基因中的重复序列会减少插入的外源DNA缺失和载体自身突变出现的概率［6］。噬菌粒虽自身携带单链M13和双链质粒的复制起始点，但噬菌粒载体缺少产生完整噬菌体所需要的结构蛋白和非结构蛋白，因此它的组装与感染需在辅助噬菌体帮助下完成。然而，辅助噬菌体稳定性较差，使噬菌粒载体的使用受到了限制。

2噬菌体展示技术淘选新型CPP

噬菌体展示技术在靶向性细胞膜穿透肽鉴定中的应用

2014年24（5）生物技术

［13］

97

。进行2～

在常规噬菌体展示技术的筛选过程中，是将靶分子包被固相载体，与噬菌体相互作用后，清洗、收集与靶分子特异结合的噬菌体进行扩增，这一过程称为生物学淘选（Bio－pan-ning）。随着淘选的不断进行，与靶分子特异性结合的多肽逐渐富集并被分离纯化。

噬菌体展示技术近年来也被运用到筛选、鉴定新型靶向特定细胞的CPP，迄今运用噬菌体展示技术淘选新型CPP的方法包括：细胞水平靶向CPP的鉴定2.1

体外淘选

体外淘选的一般步骤：将表达随机肽库的噬菌体与生长

［12］

状态良好的细胞共孵育。在孵育之前，饥饿或加入DMSO、

［7－8］

反复冻融裂解细胞得到穿膜进入细胞的噬菌体序列2.2

［14］

3轮淘选后，将得到的噬菌体克隆进行测序，分析其基因

。体内淘选

体内淘选的一般操作：把表达随机肽库的噬菌体静脉注射至动物体内

［13，15］

，噬菌体在动物体内循环一定时间后，取出

靶器官组织，充分洗涤、破碎，经纯化、扩增噬菌体，经反复淘选后测序分析特异性穿膜的噬菌体基因组中的插入片段，得到编码靶向CPP基因

［14］

，即体外淘选；模型。

动物体内进行的CPP淘选，即体内淘选

［9－11］

。MalihaZahid［13］等在进行体内淘选

过程中，预先使用氯喹处理动物，再静脉注射噬菌体，减少了

［16］

溶酶体对噬菌体的降解。MikeWhitney等分别用体内与体

外两种方式成功的验证了CPP的噬菌体靶向淘选的可行性

。

氯喹

［12，13］

以提高噬菌体的穿膜效率。充分清洗，等处理细胞，

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