YYH - 实验二 培养基的配置和灭菌(3)

响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。

3. 加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，

然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。 4. 排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。

一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。 5. 升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。

6. 保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。

如本实验中采用0.1Mpa，121.5℃，20分钟灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。

7. 降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降

至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。

8. 无菌检查：将已灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱培养24h，检查无杂菌生长后，即可

使用。

（三）过滤除菌

有些物质，如抗生素、血清、维生素、糖溶液等采用加热灭菌法时，容易受热分解而被破坏，因而要采用过滤除菌法。过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法，该方法最大的优点是不破坏溶液中各种物质的化学成分。过滤除菌法除实验室用于溶液、试剂的除菌外，在微生物工作中使用的净化工作台也是根据过滤除菌的原理设计的，可根据不同

的需要来选用不同的滤器和滤板材料。

应用最广泛的过滤器种类有：

1. 微孔滤膜过滤器：是一种新型过滤器，它由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑

料盒组成，出口处可连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盒之间，旋紧盒盖，当溶液从针筒注入滤器时，各种微生物被阻留在微孔滤膜上面，而液体和小分子物质通过滤膜，从而达到除菌的目的。其滤膜是由硝酸纤维素、醋酸纤维素等制成的薄膜，有孔径大小不同的多种规格（如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等），实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。该滤器的优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，过滤速度快，每张滤膜只使用1次，不用清洗。

2. 蔡氏（Seitz）过滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其

他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大，每张纤维板只能使用1次。

3. 玻璃过滤器：是一种玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。

玻璃滤器的规格很多，5号（孔径2~5μm）和6号（孔径<2μm）适用于过滤细菌，其优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用。

本实验采用微孔滤膜过滤器进行过滤除菌，具体操作步骤如下：

1. 组装、灭菌：将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌

后待用（0.1Mpa，121.5℃，灭菌20分钟）。

2. 连接：将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液的注射器

上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。

3. 压滤：将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。

压滤时用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。

4. 无菌检查：无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，均匀涂布，置37℃恒

温培养箱培养24小时，检查是否有杂菌生长。

5. 清洗：弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，

组装包扎，再经灭菌后使用。

整个过程应严格按照无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。