新一代测序技术之三国时代(4)

同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。

6）数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。

GS FLX系统的准确率在99%以上。其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生误差。因此，454测序平台的主要错误类型是插入-缺失，而不是替换。

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新升级让性能全面提升

去年底发布的Titanium系列试剂，是对现有GS FLX平台的重要升级。升级内容包含耗材、试剂和软件。你无需对仪器的硬件做任何昂贵的升级，只改进试剂和软件，就能立刻实现性能提升。升级之后，每轮测序能产生100万个读长片段，高质量（Q20）的读长增加至400 bp。第400个碱基的准确率是99%，之前的更高。通量也提高了5倍，目前每轮运行能获得4-6亿个碱基对，所需时间为10小时。

? PTP平板的创新重设计 重新设计之后，PTP平板上孔的密度更高，利用更小的DNA捕获磁珠进行金属覆盖，改善了信号质量，因此读长的数量和长度都明显改善，同时准确性更高。目前孔的直径是29 um，DNA捕获磁珠的大小是20 um。

? 改进的测序试剂 改进的GS FLX Titanium试剂显著降低了背景噪音，因此在几乎相同的运行时间内，读长更加长。

? 升级的软件 优化用于超高通量测序的软件，能轻松对更大、更复杂的基因组进行拼接和作图。

? GS FLX 2.0版 它与以前版本的输出数据也完全兼容，让片段能够共同拼接和作图。

广阔的应用天地

在新一代测序技术中，GS系统是最多产的。截至2008年9月，已经发表了250多篇高质量的paper。其中Nature 20篇、Science 13篇、Cell 6篇、Genome Research 20篇、PNAS 24篇。光是这些数据就让人咂舌。这些研究跨越了测序应用的多个方面：82篇全基因组测序论文包括比较基因组学的从头测序和重测序；54篇小分子RNA研究；37篇聚焦快速兴起的宏基因组学；27篇关于转录组图谱分析，包括全转录组拼接和表达图谱；13篇研究染色体结构和表观遗传学；10篇有关稀有变异检测的超深度测序这个新领域；11篇研究古老RNA。其余的文章关注454测序系统的技术和生物信息学。多种多样的应用彰显出454测序系统的能力，那些传统意义上无法用测序来解决的问题现在也一并解决了。

454测序系统除了为多项研究领域开辟了基因组分析之路，同时也加速了探索的步伐。一般来说，研究、分析、撰写并提交论文，经同行评议后发表，需要一年左右的时间。而利用Genome Sequencer系统发表论文的速度，显然表明454测序结果的数据质量高，且分析简单。超长读长与易用的分析工具相结合，让研究人员能更集中精力于科学研究，而不是研究测序过程中的某个技术细节。这样研究项目能快速完成，接着踏上新的研究道路。

与其他新一代测序平台相比，454平台的突出优势是读长。目前GS FLX系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼接和宏基因组学，它仍是最理想的选择。

去年底，美国加利福尼亚大学的研究小组利用全新的GS FLX Titanium系列试剂对海洋样品的宏基因组进行测序，发现了一种全新的蓝藻物种，文章发表在11月14日的《Science》杂志上。这项研究是系统升级后发表的首篇文章。首席研究员Jonathan Zehr对于获得数据及分析结果的速度非常震惊。他表示：“多年来我们一直试图培养这种微生物，但都没有成功。有了GS FLX Titanium，我们在几天之内就通过单次测序运行，从环境样品直接获得了宝贵的基因组信息。这个系统超长的读长对于我们从复杂的微生物群体中鉴定并分析这种独特的细菌基因组来说非常关键。”

最近，在454测序平台的协助下，研究人员完成了油棕榈的全基因组测序、拼接和注释。油棕榈是一种重要的经济作物，它的基因组很大，达17 GB。基因组的测序工作是由GS FLX Titanium系统完成的，拼接和分析则是由马来西亚一家生物信息学公司完成的。值得注意的是，这是史上第一次在没有添加传统Sanger测序数据的情况下，完成了对大且非常复杂的植物基因组进行从头拼接。这种快速经济的方法为了解多种经济作物的遗传结构打开了大门。

此外，罗氏旗下的另一家公司NimbleGen正在全球性地捕获定向重测序市场。NimbleGen序列捕获芯片与454的测序仪结合，能让完整的人外显组测序成为现实，最终将为研究流水线输送技术，并促进个性化医疗的开发。NimbleGen序列捕获技术将在后文中详细介绍，敬请留意

哦。（生物通 余亮）

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