中药郁金的指纹图谱的初步研究(6)

图11 温莪术a与桂郁金b色谱指纹图

3.8姜黄素部分测定条件

3.8 .1 测定波长

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按起始流动相配比为10%乙腈-90%乙酸(4‰)、流速1 ml/min每min变化1%浓度、对姜黄的姜黄素部分供试液进行梯度洗脱90min。记录350 nm～550 nm色谱光谱，结果见图12。由所得的三维色谱光谱图可知，分离出的三种物质在420 nm有最大吸收，结合文献[24,25]初步判定三种物质分别为姜黄素、二氢姜黄素和去甲姜黄素，根据在线光谱可知，在520 nm以后无任何吸收。为进步确定测定波长，取姜黄素适量用甲醇配制成20 μg/ml的姜黄素对照品溶液，在仪器上测定其光谱，结果见图13。由图13可知姜黄素在420 nm波长附近有的最大吸收，故选择420 nm为测定波长，550 nm为参比波长，根据高效液相色谱仪的特点，初步选择相应的谱带宽分别为16 nm和100 nm。

图12 姜黄全程梯度洗脱色谱光谱图 图13 姜黄素对照品光谱图

3.8.2 色谱条件优化

4‰乙酸的浓度相当于0.7 mol/L，根据弱酸的pH值计算得pH为2.45。基于冰醋酸在紫外光区有一定的吸收，不利于色谱指纹图谱的相关研究，因此，将流动相的中的4‰冰醋酸改为相近的4‰的磷酸，按上述梯度条件进行洗脱，结果见图14。

比较4‰乙酸和4‰的磷酸流动相的洗脱结果可知，两者在出峰的数目上无差别，仅各峰的保留时间稍有不同，用4‰的磷酸作为流动相较用4‰乙酸出峰时间稍延后。由此初步确定所用流动相中的酸及其浓度为4‰的磷酸。并以桂莪术替代姜黄进行色谱条件进行测定的结果见图15。由图15得到，桂莪术的色谱指纹图谱较姜黄的色谱指纹图谱复杂的多，另由图15得知，桂莪术在保留时间60 min后无明显的色谱峰，此时相应的流动相中乙腈的浓度为70%，故将梯度条件改为：0 min，25%A-75%B；30 min，70%A-30%B；保持至45 min。第一次优化结果见图16。

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图14 乙酸A与磷酸B全程梯度洗脱色谱图 A－4‰乙酸作流动相 B－4‰磷酸作流动相

图15桂莪术全程梯度洗脱图 图16 第一次优化色谱图

从图16得知，桂莪术在保留时间15 min外有一明显的宽峰、分离欠佳，同时在保留时间40 min后无色谱峰，相对应的流动相中乙腈的浓度为65%。基于上述原因，进行第二次优化，变更色谱梯度洗脱条件改为：0 min，25%A-75%；保持5 min；45 min, 65%A-35%B，同时为了保护色谱柱，将B的酸度降至为2‰。第二次优化结果见图17。从图17得知，桂莪术色谱分离效果得到了改善。综合分析上述试验结果，最终确定了色谱条件为：0 min， 25%乙腈-75%磷酸(0.2%)水溶液；5 min，25%乙腈-75%磷酸(0.2%)

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水溶液；45 min，65%乙腈-35%磷酸(0.2%)水溶液。

按优化确定的色谱条件分别获取温莪术与桂郁金姜黄素部分的指纹色谱图18。比较温莪术与桂郁金姜黄素部分的指纹色谱图18-A与18-B可知，温莪术与桂郁金中的8、9、11号与13、14、15号的峰位相同，结合图14可知，这三对色谱峰分别为姜黄素、二氢姜黄素和去甲姜黄素；但温莪术色谱峰强度低于桂郁金。图18另能表明，温莪术中姜黄素部分的化学成分比桂郁金姜黄素部分的化学成分复杂的多。

图17 梯度洗脱第二次优化色谱图 图18 温莪术(A)与桂郁金(B)指纹特征

由于温莪术姜黄素部分色图谱形非常复杂，为证实是否由于未除的挥发油所至，

对除去挥发油，和未除油的图谱进行比较结果见图19,另对桂郁金的除去挥发油，和未除

油的图谱进行比较结果见图20。

图19温莪术的指纹特征 图20桂郁金的指纹特征

A－未除挥发油 B－除挥发油 A－未除挥发油 B－除挥发油

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