苯酚的生物降解特性研究 - 丁霞(4)

实验七：TA克隆（8课时） （备选）

1）实验目的

TA克隆是常用的分子生物学的方法，具有操作方便、快速等优点。本实验学习TA克隆的使用技术，掌握有关的技术。 2）实验原理

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。 通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。 3）实验步骤 1、PCR产物的纯化

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增为单一条带，用PCR产物纯化试剂盒进行

纯化。具体步骤参照试剂盒说明书。 2、TA克隆

连接：纯化后的PCR产物与T载体混匀，并加入5μL的Solution I（含连接酶），置于PCR管中，16oC下过夜连接。

转化：取5μL的连接产物置于eppendorf管中，加入DH5α感受态细胞混匀，冰上放置30min；将管放到42oC水浴热激90s，冰浴2min后，加入800μl LB液体培养基，37oC，200r/min培养1h，稍离心吸取适当体积菌液涂布在含有氨苄青霉素、IPTG\\X-gal的LB培养基平板上，37oC倒置培养12-16h。

蓝白斑筛选：将平板上长出的白色菌落随机挑选若干于含LB培养基（加有氨苄霉素）的试管中培养，培养到一定的时间后，以菌细胞为模板进行PCR检测。从检测呈阳性的克隆送往公司进行序列测定。将测序结果用BLAST软件与GenBank已经录入的16S rRNA基因序列进行同源性比较。