苯酚的生物降解特性研究 - 丁霞(3)

实验五：微生物基因组的提取（4课时）

一、实验目的

掌握微生物总DNA的抽提方法和基本原理。 二、材料、试剂及器具

耗材：吸头塑料制品（包括吸头、EP管等），EP管架

试剂：TE溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0），醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），酚/氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇，醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），无水乙醇，溶菌酶（20mg/ml 无菌水配置，-20°store），RNA酶（10mg/ml，in 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 15mM NaCl, 100℃加热5min，冷却，-20°store），蛋白酶K（20mg/ml，in 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 2.9mg/ml CaCl2, 50% 甘油，-20°store）

仪器：高速冷冻离心机，-20 oC冰箱，移液器，恒温水浴锅 三、实验步骤

1. 将细菌接单菌落接种于培养基中，30oC，150r/min培养过夜。

2. 5000r/min离心2min，TE洗涤一次，再次离心，重悬菌体于0.5mlTE中。 3. 加入20μL 20mg/ml的溶菌酶和20μL 10mg/ml RNA酶，混匀，于37oC保温1h。

4. 加入20μL 20mg/ml的蛋白酶K于37oC保温1h。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，10000r/min离心5min，将上清液转入一新1.5ml EP管中。

6. 加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5min，将上清液转入一新管中。

7. 加入1/5体积的醋酸钠溶液（3mol/L，pH5.2），两倍体积的无水乙醇，颠倒几次离心管混匀。-20oC放置2h，10000r/min，4oC离心5min，倾去上

清液。

8. 70%乙醇洗涤沉淀两次，室温下晾干后，溶于0.1ml TE中，置于4oC冰箱中，待用。

思考题：

1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? 氯仿, 乙醇。 2. DNA提取过程中应注意什么?

实验六：PCR扩增16s RNA（4课时）

以细菌的总DNA为模板，以16S rRNA通用引物对16S rRNA基因片段进行扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。 一、实验目的：

PCR和琼脂糖凝胶电泳是常用的分子生物学的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习PCR扩增、DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、材料、试剂及器具 1、材料

微生物基因组，引物

BSF8/20 BSR1541/20 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 2、试剂

Taq DNA聚合酶；dNTP；灭菌的去离子水；100ul EP管；加样缓冲液（6×）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）；0.5×TBE电泳缓冲液(每升含有54g的Tris，27.5g的硼酸和20ml的0.5mol/L的EDTA（pH8.0）)；DNA Marker。 3、器具

（1）PCR扩增：PCR仪、吸头塑料制品（包括吸头、EP管等） （1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等 （2）紫外透射仪 三、实验步骤： 1）PCR扩增

以基因组为模板，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。向PCR反应管中依次加入：

去离子水 PCR缓冲液 dNTPs 上游引物 下游引物

16.75μl 2.5μl 1μl 1μl 1μl

DNA

Taq DNA聚合酶

反应条件为：

34 cycles

2）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果

1μl 0.25μl

95°C 95°C 54°C 72°C 72°C

5 min 30s 30s 1.5min 10min

1、按所分离的DNA分子的大小范围，称取适量的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶

中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。

2、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好

胶带与胶槽之间的缝隙。

3、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，

使之形成均匀水平的胶面。

4、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳

槽内。

5、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面

6、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的

加样孔中。1μl加样缓冲液（6×）+5μl待测DNA样品（+0.5μlEB液（10mg/ml）（注：若胶内未加EB，可选用此法）。）

7、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，

开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

8、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止

电泳。

9、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，

放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约30min。

10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染

色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。

思考题：

1. 退火温度Tm是如何计算得到? 2. PCR循环次数是否越多越好?