苯酚的生物降解特性研究 - 丁霞(2)

比较两种测量苯酚的方法，哪种方法更好，说明理由。

实验二：各种因素对菌株降解苯酚的影响（16课时）

一、实验目的

采用单因子分析，分别考查苯酚浓度、温度、pH 值、NaCl浓度，溶氧量（摇床转速）、碳源、等环境因素对降酚菌生长和降解苯酚能力的影响。进而确定菌株的最佳生长和苯酚降解特性。 二、材料、试剂及器具 1、材料 降解菌 2、试剂

苯酚，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，水杨酸苯酯，对氨基苯磺酸，对羟基苯甲酸甲酯，对硝基苯酚，水杨酸甲酯，甲萘胺，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺，NaH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，pH试纸等。 磷酸缓冲溶液(pH8. 0)：

NaH2PO4?2H2O 94.7g，NaH2PO4?2H2O 5.3g，溶解，定容至1L； 无机盐培养基（g·L-1）

NH4NO3 1.0，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.2；苯酚 0.5（培养基灭菌后，再加入苯酚）； 3、器具

摇床、恒温培养箱、灭菌锅、电子天平、超净工作台、磁力搅拌器、分光光度计、三角瓶。 三、实验步骤

1）苯酚浓度的测定——4-氨基安替比林直接光度法

见实验一的方法

2）降酚菌生长与降解特性的研究 1. 各种不同碳源下菌株的生长情况

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。分别接入含有其它碳源（不含苯酚）的无机盐培养基中，观察菌株在各种不同碳源上的生长情况。

参考碳源：葡萄糖，苯酚，淀粉，水杨酸苯酯，对氨基苯磺酸，对羟基苯甲酸甲酯，对硝基苯酚，水杨酸甲酯，甲萘胺，苯，萘，蒽，二甲苯，菲，硝基苯，氯苯，多氯联苯，2-氯甲苯，苯甲酸，邻苯二胺等； 2. 苯酚浓度对菌株降酚能力的影响

取2%接种量，苯酚浓度分别为100，250，500，750，1000，1 500mg/L 的培养基中，37度，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。 3. pH对菌株生长和降解苯酚能力的影响

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。pH值分别为3、5、7、9、11，37度，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。 4. NaCl对菌株生长和降解苯酚能力的影响

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中。NaCl浓度分别为0.05%，0.1%，0.5%，1%，3%，15%，150 r/min下进行培养，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。

思考题：

确定菌株的最佳生长和苯酚降解特性时，上面的因子分析是否充分，实验结果表明哪种因素的影响最大？还有哪些因子需要考虑？

实验三 降解菌生长和降解曲线的测定 （8个学时）

一、 实验目的

学习微生物生长曲线的测定，掌握苯酚降解菌苯酚降解曲线的测试。 二、材料、试剂及器具 1、材料 降解菌 2、试剂

苯酚，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，NaH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O，硫酸铵，pH试纸等。

磷酸缓冲溶液(pH8. 0)：

NaH2PO4?2H2O 94.7g，NaH2PO4?2H2O 5.3g，溶解，定容至1L； 无机盐培养基（g·L-1）

NH4NO3 1.0，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7.2；苯酚 0.5（培养基灭菌后，再加入苯酚）； 3、器具

摇床、恒温培养箱、灭菌锅、电子天平、超净工作台、磁力搅拌器、分光光度计、三角瓶。 三、实验步骤

1）苯酚浓度的测定——4-氨基安替比林直接光度法

见实验一的方法

2）降解菌生长和降解曲线的测定

取2%接种量，500mg/L苯酚的无机盐培养基中，共培养两天。理论上每隔4小时（此次实验周二下午2点接种，第二天上午10点和下午2点，第三天上午10点和下午2点共测试四次），0D600测定降解菌生长曲线的测定，同时测定苯酚浓度，并绘制生长和苯酚降解曲线。

思考题：

测定了其生理生化的特性指标和生长曲线, 对其降解特性进行了初步了解, 如何对菌株的降解条件进行优化？

实验四 苯酚生物降解的途径及其降解关键酶 （8学时）

一、实验原理

苯酚的降解基因通常排列成簇，位于大质粒上，部分位于染色体上。在好氧菌中，苯酚羟化酶基因是降解苯酚的关键基因，编码苯酚降解途径的第一个酶，将苯酚转化成邻苯二酚，邻苯二酚进一步开环裂解为三羧酸(TCA)循环产物，从而进入物质和能量的代谢。

邻苯二酚的开环裂解是在不同酶的作用下，经过不同的降解途径实现的。

其中，以邻苯二酚2，3双加氧酶(C23O)催化的开环途径称为间位裂解途径，邻苯二酚通过间位开环产生黄色的2-羟基粘糠酸半醛以及α-酮基己二酸中间物。假单胞菌主要通过这个途径降解苯酚。

以邻苯二酚1，2加氧酶(CatA，C120)催化的开环途径称为邻位裂解途径，邻苯二酚邻位开环裂解产生粘康酸，以及内脂和琥珀酸等无色的中间物。醋酸不动杆菌等以此途径降解苯酚。由上述两途径中形成的乙酰辅酶A、琥珀酸、丙酮酸等可以进入三羧酸循环(TCA)，继续被微生物利用。一部分生成细胞物质，另一部分则被氧化分解为二氧化碳和水，提供微生物新陈代谢所需的能量。在微生物降解苯酚的过程中，需要其多酶系统和氧的辅助来共同完成。

二、实验材料

⑴50mM磷酸缓冲液（pH 7.0，K2HPO4 14.022g/L；KH2PO4 5.236g/L） ⑵50mM磷酸缓冲液（pH 7.6，K2HPO4 19.745g/L；KH2PO4 1.822g/L） ⑶邻苯二酚（儿茶酚）20μmol/L

三、实验步骤

3.1 粗酶液制备

①分别接种PD，DX，QY三种菌落于50ml无机盐培养基中，37℃震荡培养过夜。

②培养液于4℃，4000r/min离心，沉淀在缓冲液中洗涤一次并重悬。 ③将重悬液在冰浴中超声波破壁50个循环（5秒工作，10秒停顿）。 ④将悬液在4℃，12000r/min离心20min，上清转入新管得粗酶液。

3.2 测定方法

500μl测定体系如下（实际操作时可加6个体系使比色皿中液层厚度为3cm）：

①邻苯二酚1,2-双加氧酶（C120）

50mM磷酸缓冲液（pH 7.0）440μl；儿茶酚（20μmol/L）10μl；粗酶液50μl；测定在OD260下的变化。

②邻苯二酚2,3-双加氧酶（C230）

50mM磷酸缓冲液（pH 7.6）440μl；儿茶酚（20μmol/L）10μl；粗酶液50μl；测定在OD375下的变化。 3.3 蛋白标准曲线的绘制 所用试剂：

1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml95%的乙醇中，加入

100ml85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1L，滤纸过滤。最终试剂含有0.01%考马斯亮蓝G-250,4.7%乙醇，8.5%磷酸。

2）标准蛋白溶液：牛血清蛋白（PBS）用0.15mol/L的NaCl配成1mg/ml蛋白

溶液

3）50mM磷酸缓冲液：PH7.0，K2HPO4 14.022g/l，KH2PO4 5.236g/l 取7组三角瓶，分别按下表平行操作

表2-2 蛋白标准曲线测定组分表

试管编号

0

1 1 9 5

2 2 8 5

3 3 7 5

4 4 6 5

5 5 5 5

6 6 4 5

标准蛋白溶液（ml） 0 0.15mol/lNaCl（ml） 10 考马斯亮蓝试剂5 （ml）

摇匀，20min内以0号管为空白对照，在595nm处比色。以A595为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。 3.4 测定细胞裂解液蛋白质浓度

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