18种天然氨基酸分析(2)

图1为18种氨基酸-PITC以及氨-PITC的分离情况，各目标化合物间的分离度超过2.0，分离情况较好，定量更加准确。即使色谱柱柱效稍有下降，分离情况也不会受到影响。能够采用PITC柱前衍生-Diamonsil AAA氨基酸柱分析的氨基酸包括Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种氨基酸。

Cys-CysLysIleLeuNlePheTrp40SerGlyHisAspGluArgThrAlaProTyrVal10NH320Time (min)Met30

图1 18种天然氨基酸-PITC以及氨-PITC的液相色谱图(Nle为内标物)

4.1.2 奶粉

图2为奶粉水解液经PITC衍生、Diamonsil AAA氨基酸柱分离后的液相色谱图，由图可知除色氨酸(Trp)外，其余17种氨基酸全部检出，并达到较好分离。表1中数据为定量结果，氨基酸总含量为17.49%，接近厂家标示的蛋白质含量(约18%)。除胱氨酸外，平行样品的氨基酸含量以及总含量的RSD均小于3.0%，表明该方法具有较高的重现性。胱氨酸含量较低，因而数值偏差较大一些；色氨酸无法检出是因为酸水解过程中，色氨酸被破坏，色氨酸分析时建议采用碱水解法。

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GluProAmmoniaAspSerArgThrAlaValIleLeu1020Time (min)30Cys-CysGlyHisTyrMetPhe40Lys

图2 PITC柱前衍生法分析奶粉水解液中氨基酸的液相色谱图

表1 某品牌奶粉中氨基酸含量(PITC柱前衍生法)

化合物 Asp Glu Ser Gly His Arg Thr Ala Pro Tyr Val Met Cys-Cys Ile Leu Phe Trp mol/100 g奶粉 0.0099 0.0268 0.0091 0.0044 0.0028 0.0036 0.0059 0.0059 0.0148 0.0037 0.0087 0.0026 0.0002 0.0064 0.0129 0.0048 0 7

质量分数/% 1.32 3.94 0.95 0.33 0.43 0.63 0.70 0.53 1.71 0.66 1.02 0.39 0.04 0.84 1.69 0.80 0 RSD(n=6)/% 1.73 1.34 2.45 2.77 2.65 2.08 2.41 2.55 1.62 2.39 1.84 2.93 3.85 2.07 1.15 2.44 0 Lys 总量

4.1.3 饲料

0.0054 0.1279 0.80 17.49 2.56 1.92 图3为饲料水解液经PITC衍生、Diamonsil AAA氨基酸柱分离后的液相色谱图，由图可知除色氨酸(Trp)外，其余17种氨基酸全部检出，并达到较好分离。由表2中数据可知氨基酸总含量为43.48%，与厂家标示的蛋白质含量43%相当。平行样品的氨基酸含量以及蛋白质含量的RSD均小于3.5%，表明该方法具有较高的重现性。色氨酸无法检出是因为酸水解过程中，色氨酸被破坏，色氨酸分析时建议采用碱水解法。

GluAspGlyAmmoniaAoPlraSerThrArgValLeuNle1020Time (min)30Cys-CysHisTyrMetPhe40IleLys

图3 PITC柱前衍生法分析饲料水解液中氨基酸的液相色谱图(图中的Nle为内标物) 表2 某品牌鱼饲料中氨基酸含量(PITC柱前衍生法)

化合物 Asp Glu Ser Gly His Arg Thr Ala mol/100 g饲料 0.0310 0.0520 0.0211 0.0370 0.0069 0.0193 0.0136 0.0254 质量分数/% 4.12 7.65 2.22 2.78 1.07 3.36 1.62 2.26 RSD(n=6)/% 2.25 1.42 2.87 2.64 3.02 1.93 2.83 3.15 8

Pro Tyr Val Met Cys-Cys Ile Leu Phe Trp Lys 总量

4.1.4 氨基酸注射液

0.0220 0.0075 0.0180 0.0051 0.0009 0.0136 0.0247 0.0118 0 0.0218 0.4170 2.53 1.36 2.12 0.76 0.21 1.79 3.24 1.95 0 3.19 43.48 2.77 3.23 1.99 2.84 3.46 2.91 0.98 2.69 0 2.26 2.44 图4和表3是某品牌氨基酸注射液的分析结果。由数据可知，全部18种氨基酸均达到较好分离；从检出值来看，除胱氨酸外，其他17种氨基酸的检出值与配方值偏差不超过±3.5%。胱氨酸含量较低，因而分析偏差更大一些。

GlyLeuArgThrAlaValAspMetCys-CysSerHisGluProIle1020Time (min)Tyr30Trp40PheLys

图4 PITC柱前衍生法分析氨基酸注射液的液相色谱图

表3 某品牌氨基酸注射液的检出浓度(PITC衍生法)

化合物 Asp 配方浓度(g/L) 2.50 9

检出浓度(g/L) 2.46 Glu Ser Gly His* Arg* Thr Ala Pro Tyr Val Met Cys-Cys Ile Leu Phe Trp Lys* 0.75 1.00 7.60 1.85* 4.53* 2.50 2.00 1.00 0.25 3.6 2.25 0.10 3.52 4.9 5.33 0.90 4.30 0.76 0.99 7.49 1.86 4.66 2.42 1.95 1.01 0.26 3.56 2.17 0.08 3.49 4.79 5.22 0.90 4.18 *厂家生产注射液时，这3个化合物是以水合形式或HCl盐形式添加的，表中是经过换算得到的它们真实的配方浓度。

4.2 2,4-二硝基氟苯衍生法 4.2.1 标准溶液

图5是19种氨基酸-DNFB衍生物以及氨-DNFB衍生物的液相色谱图。通过DNFB衍生、Diamnsil AAA氨基酸分析柱分析，包括 Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)以及Cys(半胱氨酸)等19种氨基酸能够被准确定量。

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