蛋白质测定方法(4)

的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm与225nm的吸收差法

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225

以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。

本方法在蛋白质浓度 20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。 4. 肽键测定法

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的 5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。

本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

血浆游离血红蛋白测定

血红蛋白具有类过氧化物酶活性，可催化H2O2释放新生态氧，使邻甲联苯胺氧化发生颜色变化，由无色最终变为蓝紫色。根据显色深浅与标准进行比较，可测出其含量。 实验方法

材料：1．2g/L邻甲联 实验原理

血红蛋白具有类过氧化物酶活性，可催化H2O2释放新生态氧，使邻甲联苯胺氧化发生颜色变化，由无色最终变为蓝紫色。根据显色深浅与标准进行比较，可测出其含量。

实验方法 材料：

1．2g/L邻甲联苯胺溶液 2．1%H2O2 3．10%醋酸溶液 4．分光光度计 方法：

1.抽取静脉血2-3ml，枸橼酸钠抗凝，离心分离血浆。

2．按下表进行操作，用分光光度计，波长为530nm，以空白管调零，测定测定管的吸光度。

试剂 （ml） 2 g/L邻甲联苯胺溶液

患者血浆 1% H2O2

测定管 0.5 0.02 0.5

混匀后室温放置10min

10%醋酸溶液

5.0 室温放置10min

3.计算公式

血浆游离Hb(mg/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×100 实验结果计算 参考范围：0-40mg/L 注意事项

1.一切容器避免血红蛋白污染；

2.采血要顺利，器皿要干燥，检测血浆要新鲜，及时分离，防止人为溶血； 3.邻联苯胺溶液具致癌性，检测时要小心，废液要妥善处理，以免污染； 4.双氧水要新鲜配置，浓度要准确。

5.0 空白管 0.5 / 0.5