蛋白质测定方法(3)

一、制作标准曲线

取7支试管，按下表平行操作： 试管编号

1

试剂处理

标准蛋白质溶液（mL） 蒸馏水（mL） Folin-酚甲试剂（mL）

0 1.0 5.0

0.1 0.9 5.0

0.2 0.8 5.0

0.4 0.6 5.0

0.6 0.4 5.0

0.8 0.2 5.0

1.0 0 5.0

2

3

4

5

6

7

摇匀，于20—25℃放置10min Folin-酚乙试剂（mL）

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白， 在640nm处比色 A640

绘制标准曲线：以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 二、未知样品蛋白质浓度测定 取2支试管，按下表平行操作： 试管编号 试剂处理 血清稀释液 (mL) 蒸馏水 (mL) Folin－酚甲试剂(mL)

空白管 ×2 0 1.0 5.0

样品管 ×2 0.2 0.8 5.0

摇匀，于20—25℃放置10min Folin－酚乙试剂(mL)

0.5

0.5

迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色 A640

三、计算

注意事项

(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。

(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。

蛋白质含量的定量测定——双缩脲法（Biuret法）

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。 实验原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。

紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：

试剂和器材 一、试剂 双缩脲试剂：

取1.5g硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0g的酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 · 4H2O）溶于500mL蒸馏水中，在搅拌下加入300mL 10%NaOH溶液，用水稀释至1000mL。此试剂可长期保存、备用。

二、标准和待测蛋白质溶液 标准蛋白溶液：

10mg/mL结晶牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。 待测蛋白质溶液：

人血清（稀释10倍）。测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。 三、器材

试管1.5×15cm（×16），试管架，移液管1mL（×3）；5mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。 操作方法

一、制作标准曲线

取12支试管分成两组，按下表平行操作：

0 0 0 1.0 4.0

1 0.2 2.0 0.8 4.0

2 0.4 4.0 0.6 4.0

3 0.6 6.0 0.4 4.0

4 0.8 8.0 0.2 4.0

5 1.0 10.0 0.0 4.0

标准蛋白液(mL) 蛋白浓度(mg/mL) 蒸馏水(mL) 双缩脲试剂(mL)

充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30min A540

取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 二、样品测定

取4支试管分成两组，按下表平行操作：

0 0 1.0 4.0

1 0.5 0.5 4.0

血清稀释液 (mL) 蒸馏水 (mL) 双缩脲试剂 (mL)

充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30min A540 三、计算

取两组测定的平均值计算：

血清样品蛋白质含量（mg/100mL）=

其中,Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/mL），N为稀释倍数，V为血清样品所取的体积（mL），c为样品原浓度（mg/mL）。 注意事项

（1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

紫外吸收法测蛋白质含量

1.280nm的光吸收法 2.280nm和260nm的吸收差法 3.215nm与225nm的吸收差法 4.肽键测定法

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量

时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 1. 280nm的光吸收法

因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。

许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为 1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。

蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml) (Q …… 此处隐藏：1810字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……