western-blot条带分析及解决方法(2)

Western 条带分析及解决方法---刘健锋

*注8 这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并

获得较好的效果，对新手似乎更好。

*注9 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。单

用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低

*注10 一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。

*注11 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。

*注12 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。

Western 条带分析及解决方法---刘健锋

*注13 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。我的办法

是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。

*注14 膜平衡不均或有油脂污染的表现是膜上有疏水的通明色和蛋白几无（丽春红染），这点并不多见。

*注15 这一点我是抄pierce的说明书的，我没遇到过，膜与X光片间有气泡也不影响荧光通过，这个我可以肯定。似乎不透明的东西才会导致。

*注16 非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有，我也遇到过。关于wetern的抗体选择在此提出我的观点：最理

想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素，不包含每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合，很少有人这么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差，我觉得是实际中的首选。单抗虽然特异性好，但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度为会下降甚至为0，故不稳定。普通多抗虽然表位多，但因含其他抗体，特异性差了好多，会有很多杂带乃至背景。实际我做的

Western 条带分析及解决方法---刘健锋

抗体多数都是普通多抗，只要封闭的好，效果还是很不错的；单抗虽说不稳定，但实际中我都能做出来，尤其是内参，强烈推荐只选单抗。

*注17 此点我根本不知道，完全是拷贝pierce说明书的

*注18 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，这些东西对封闭无益。我所有的牛奶全是配好后在4度静置（最好放在尖底的管子内），这样那些

大颗粒就会沉淀到底部，吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀，我只吸上面的，下面的颗粒则不要取。如是则在也没有遇到这种现象。不推荐过滤牛奶，因为耗时极长且得率极低。我用过几次但后来废弃了这种做法。

注1 另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色

注2

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大

Western 条带分析及解决方法---刘健锋

注7 高背景 注16 非特异性条带 注18 散在小圆斑

因为封闭不充分,这3者很容易联合出现,下面是一张典型图,3者均含

注16

Western 条带分析及解决方法---刘健锋

非特异性条带

下面是一张非特异性较高的图,虽有背景但相对较低

注13

主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上

气泡主要是中间一条带的上缘的半圆形缺失.我实际的片子上可以隐约看出是一个圆形的气泡,周围一圈还有个很形象的边界

再提供一个如何在western显影图上判断蛋白降解的例子.

如下图,与最右边一条带相比,左边3条带显影分子量散落下移（不能有上移，因分子量变小），拖拉一片，即为降解。在考染胶上判断有无降解一是大分子量是否完全，二是背景是否清晰，三是小分子量区是否模糊。降解是非均一性的，蛋白会不同程度断裂形成大大小小的片段。在胶上则降低各条带含

Western 条带分析及解决方法---刘健锋

量，增加条带间蛋白形成背景，小片段在小分子量区堆积。在western显影图（我这张图用的是多抗）则体现为分子量递减的一连续片段（就如同一群人有人断胳膊，有人断腿，有人断头，有人断手指，有人什么也没丢，大家断的是随机的，断下来的都坠落在小分子量区，剩下的从统计上来看就是以原分子量为首的一段区域。我用的是多抗，所以可识别这一群片段，如果是单抗，则只能识别那些表位完整的片段，就不是这种图形了。没做过，猜测是稍微增长的一段（肯定比多抗短的多），但要淡得多。