《环境微生物的检测与分析》实验指导20150113(2)

加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8、灭菌

将上述培养基于121摄氏度湿热灭菌30 min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9、摆斜面

灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固，

10、无菌检查

将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（2）、配制高氏一号培养基

高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。

配方如下： 可溶性淀粉20g KNO3 1 g NaCl 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01 g 琼脂20g 蒸馏水1000mL pH7.4~7.6

1、 称量和溶解

先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少许少量少于所需的水量，放入锅中在电磁炉上边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配制成高浓度的储备液后再加入，方法是先在100 ml 水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成0.01 mg/ml的储备液，再在1000 ml的培养基中加入以上储备液0.1 ml即可。待所有的药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2、pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同上。 （3）配制马铃薯蔗糖培养基

马铃薯蔗糖培养基是用于分离真菌的选择培养基。

配方如下： 去皮的马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 蒸馏水1000mL，自然pH

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1、称量和溶解

先计算后称量，按用量称取各成分。将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少于所需的水量在电磁炉上加热20 min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。

2、同（2）2

（二）制备土壤稀释液 （1）取土壤

取表层以下 5~10 cm 处的土壤样品，放入灭菌的牛皮纸袋中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。

（2）土壤预处理及保存

将采集的样品带回实验室平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并检出植物根、茎、叶及石块等杂物，约20号筛筛分。土壤处理好后备用，或放在4摄氏度冰箱暂存。

（3）制备土壤稀释液（要无菌操作） 1、制备土壤悬液

取土样 5 g，迅速倒入带玻璃珠的45 mL无菌三角瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），置摇床中振荡 5~10 min，使土样充分打散，即成 10-1 的土壤悬液。

2、稀释

用无菌移液管吸10-1 的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL 无菌水中，震荡混匀即为10-2 稀释液，如此重复，可依次制成10-2 ~10-9 的稀释液。注意：操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

（三）混菌测定菌落数的方法 1、细菌

取10-7，10-8，10-9三管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平培养皿中，每个稀释度接三个培养皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满培养皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动培养皿，使菌液与培养基充分混均，但不沾湿培养皿的边缘，待培养基凝固即成细菌平板，倒平板时注意无菌操作。

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2、放线菌

取10-4，10-5，10-6 三管稀释液，在每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从三管吸出1ml加入相应标号的培养皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成放线菌平板。

3、霉菌

取10-1，10-2，10-3三管稀释液各1ml，分别接入相应的培养皿中，每个稀释度接三个平皿。在溶好的马铃薯蔗糖固体培养基中，每100ml加入灭菌的乳酸1ml，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成霉菌平板。

将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即培养皿盖朝下放置，于 28~30 摄氏度恒温培养，细菌培养 1~2d，放线菌培养 5~7d，霉菌 3~5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。

（四）稀释倒平板法测定菌落数的方法 1、倒平板

将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基分别放入微波炉中熔化，将熔化好的培养基冷却至50摄氏度至超净工作台中倒入灭菌好的培养皿中，待冷却后编号备用。

2、吸取土壤稀释液

用无菌吸管吸取取10-7，10-8，10-9三管土壤稀释液各0.1 mL对号接种在不同稀释度编号的牛肉膏蛋白胨培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离细菌。

用无菌吸管吸取取10-4，10-5，10-6两管土壤稀释液各0.1 mL对号接种在不同稀释度编号的高氏一号培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离放线菌。

用无菌吸管吸取取10-1，10-2，10-3 两管土壤稀释液各0.1 mL对号接种在不同稀释度编号的马铃薯蔗糖培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离霉菌。

3、涂布平板

用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20~30min使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养。 注：无菌操作要点

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火焰消毒：在无菌环境中进行培养或进行其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后所有的操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都要在火焰附近操作并经过灼烧进行。但要注意：金属器械不能在火焰中灼烧时间过长，以防退火，烧过的金属要待冷却后才能夹取物品，以防造成物品损伤。吸过营养液的吸管不能再次进行灼烧，因残留在吸管中的营养液能被烧焦成碳膜，再用时会把有害物带入培养液中。开启、关闭长有微生物的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止温度过高烧死细胞。另外，有橡胶塞的试管也不能灼烧时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养的微生物。

无菌操作：进行无菌操作前用75%的酒精擦拭超净工作台面及双手。进行无菌操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已经消毒的物品，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。为了拿取方便，工作台面上的东西要有合理的布局，原则上应将右手使用的东西放在右侧，左手使用的东西放在左侧，酒精灯放在中央。工作由始至终要保持一定的连续性，组织和细胞在未做处理前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；如果用过之后不再重复使用，应立即封闭瓶口直立。吸取各种液体时，均应分别使用吸管，吸管不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能向操作台面讲话或咳嗽，以免细菌或支原体带入工作台面发生污染。

（五）平板菌落计数

按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克土壤中的含菌数。

1、同一稀释度各个重复的菌落数相差不太悬殊。

2、细菌、放线菌以每培养皿30~300个菌落为宜，霉菌一每培养 …… 此处隐藏：2673字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……