线虫RNA干扰的基因沉默(3)

五、实验结果分析

一）RNA甲醛变性凝胶电泳鉴定图

在电泳图中与MAKER条带对比可以发现三条条带，由远及近分别为18srRNA、18srRNA、5srRNA。其中，5srRNA含量少，所以条带较暗，很不清楚；18srRNA、28srRNA条带均很亮，条带边缘比较清晰，而且28srRNA条带的亮度可以达到18srRNA条带亮度的2倍，说明我们组提取的RNA没有被降解。但是在上样孔处有一条暗暗的条带，查阅资料说，上样孔处如果有条带，说明有DNA污染。整个组基本上都存在或明或暗的条带，但是从后面的结果来看，其他大多数组都没什么影响，只有我们组出现了一条杂带，所以，我认为，少量的DNA污染对实验结果的影响较小。不过，不能排除影响的存在，所以在RNA沉淀以及沉淀分离的过程中一定要多加注意，要把上清弃的干净些，否则稍有的才能留可能会造成很大的影响。

二）DNA琼脂糖凝胶电泳检测图

我们是第一大组第四小组，从最后的实验结果来看，我们组确实获取到了RNA，逆转录得到了cDNA,因此也在PCR之后扩增得到了Acting 的基因片段。但是，唯一的缺憾是，我们的电泳条带中竟然多出了一条较清晰明亮的杂带，第3小组也有，但是亮度很暗，我也看了第二大组的结果，未出现相同的状况。 通过在网上查阅资料，分析在该过程中出现杂带的原因：1、内参引物的特异性不好，可能是非特异性扩增导致。2、反转的cDNA里面含有较多的基因组DNA，可能是RNA提取质量不到位导致，碰巧这对内参引物横跨了内含子，从而导致PCR出现2条带。加上之前RNA 点用的结果，整体分析，我觉得出现杂带的原因是之前RNA提取的不到位，含有少量的DNA ，在整个过程中，大家所添加的引物都是相同的，所以，应该不会产生非特异性扩增，在之前的RNA电泳结果中，我们组的上样孔处有杂带，是有DNA污染的迹象。不过，其他组的RNA电泳结果也存在DNA污染，最终的DNA电泳结果却未出现杂带，排除宏观因素，如果是在我们添加引物的时候我们出现问题，添加过少、之后未被混匀等的因素，也是有可能。

六、实验注意事项

1、由于RNA酶是极易被降解的，所以整个过程一定要带手套和口罩。而且用试剂的时候一定要仔细看好了，在添加的时候一定要添加去RNA酶的等经过处理的。

2、在加入异丙醇沉淀RNA要混匀，使RNA充分沉淀，弃上清，要干净，再加入乙醇后，也要充分混匀并将上清弃的干净，否则若残留DNA，对后面实验的会产生影响。

3、提取到的RNA要待RNA沉淀完全溶解后再进行RT-PCR反应。 4、其余步骤主要按照实验书和老师授课的认真做。 七、思考题

1、如何防止提取过程中RNA的降解？

1）尽量避开RNA专用操作区，离心机、移液器、试剂等均专用，并保持清洁。 2）操作过程中应始终戴一次性PE手套，并经常更换，戴口罩避免交谈。 3）尽量使用一次性已去除RNA酶的塑料制品、吸头、离心管等以防交叉感染。 4）配制用的酒精、异丙醇、TRIS等应采用未开封的新瓶。 5）玻璃和金属器皿需要180℃干烤6-8h。 2、提取的RNA 有什么应用？

1）逆转录形成cDNA，PCR扩增后可用于基因工程。 2）成为dsRNA，用于RNA干扰技术。 3、确定RNA质量的方法有几种？ 1）检测RNA溶液的吸光值 A260/280=2 时为纯的RNA A260/280=1.8时为双链DNA

A260/280>2.2,时RNA已水解为单核酸

2）RNA电泳图谱：变性凝胶电泳，与Maker进行对比。