CRISP原理 - 图文(2)

速采集。

II型系统中虽然未观察到最初采集，但Cas9 也是protospacer筛选的必要元件，这表明在靶向干扰与外源DNA采集之间存在一种功能性联系。近期还有研究发现了编码anti-CRISPRs 蛋白的不同病毒基因，指出了干扰以上不同阶段，能颠覆CRISPRs 系统。

Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation.

一些证据表明，某些Cas酶（未包括Cas9）自身可以操控记忆形成过程。基于Cas9识别切割位点的方式，研究人员猜测Cas9在记忆形成中也发挥了作用。

除了匹配CRISPR引导序列和病毒DNA，Cas9需要在附近寻找第二信号：病毒DNA中的前间区序列邻近基序( protospacer adjacent motif，PAM)序列。这是一个至关重要的步骤，因为PAM序列的存在阻止了Cas9攻击细菌自身包含记忆的DNA。

为了检验他们的假说，研究人员交换了化脓链球菌和嗜热链球菌免疫系统的Cas9酶，它们各自识别不同的PAM序列。结果，PAM序列跟随着在两种细菌之间发生了交换——表明在记忆形成中Cas9负责了PAM的识别。

Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

实验操作

1、根据靶序列设计 RNA 序列；

设计sgRNA，提供的序列经过blast，优选脱靶效应最低，此外，为进一步提高sgRNA的特异性和降低脱靶效应，提供双切口sgRNA对设计（Figure1）。

Figure 1.Schematic illustrating DNA double-strandedbreaks using a pair of sgRNAs guiding Cas9 D10Anickases (Cas9n).

2、sgRNA表达载体构建，或sgRNA体外转录合成

A、sgRNA表达载体构建（试剂盒Precut SgRNA Cloning kit &pSD-gRNA Plasmid）

质粒pSD-gRNA 专门用于在哺乳动物细胞中表达sgRNA，该质粒含CMV 启动子驱动的GFP 报告基因表达框，与Cas9表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能。此质粒含氨苄抗性用于阳性克隆筛选，试剂盒提供预剪切线性质粒，可以直接进行连接筛选阳性克隆，降低了酶切质粒不完全导致假阳性克隆的出现几率。 B、sgRNA体外合成。

sgRNA合成纯化试剂盒（T7 sgRNAMICscriptTMKIT&EzOmicsTMRNA QUICK clear KIT）体外转录的sgRNA与质粒表达的sgRNA相比，更简便快捷，省去了质粒构建的步骤，整个操作过程仅需20h（包括过夜孵育）。转录纯化后的sgRNA可直接进行转染及细胞显微注射。 （1）sgRNA合成引物（反向引物设计为固定模式） （2）PCR kit（e.g. pfu DNA polymerase） （3）T7 sgRNAMICscriptTM KIT

（4）EzOmicsTM RNA QUICK clear KIT-------一步纯化RNA 转录产物

简单三步实现sgRNA轻松合成

3、全基因组sgRNA文库的构建（用于全基因范围的基因打靶，构建突变体库） （1）根据物种信息，进行生物信息统计

（2）针对物种的全基因组进行 RNA 序列设计

（3）根据设计结果合成 RNA 或构建sgRNA表达载体库

（4）sgRNA表达质粒和合成的RNA 文库，质粒及RNA 质量分析报告。

4、CRISPR/Cas9 载体

有多种cas9 表达载体及其sgRNA共表达载体，三种不同的突变用于不同的应用，例如双切口敲除、单切口敲除、抑制转录、启动子激活等。

5、sgRNA活性检测

包括SSA luciferase 报告系统、Surveyor 法、Q-PCR、突变点基因测序等 （1） SSA 检测：根据要求检测sgRNA的活性及敲除效率，也可以选购

BiomicsPrecutpSG-target Cloning kit 自行构建报告载体用于检测，提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target 质粒。

检测原理：SSA 报告质粒(pSG-target)中luciferase 基因被终止密码子提前终止，这种截短的luciferase 没有活性。为检测sgRNA的剪切活性，将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9 和sgRNA的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase（Figure 2），通过检测luciferase 的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性（Figure 3）。

Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombination

Figure 3.Increased FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells. （2） Surveyor 法及测序验证

CRISPR/Cas9 打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN 基本一致，都是NHEJ 或是HR。因此在CRISPR/Cas9 的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN 和TALEN 方法.主要包括有:靶位点直接PCR 后TA 克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法（Surveyor 法）。

Surveyor 法即错配酶法：靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR 扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（主要是CEL1 或T7E1 酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。

6、稳定表达Cas9 蛋白细胞株筛选（Stable CAS9 Protein expressing cell line screening） 通过抗性基因的筛选，筛选出稳定表达的 Cas9 细胞系。使用该细胞系筛选sgRNA时，不需要额外转染表达Cas9 的质粒，简化试验操作，提高试验的可重复性。

7、利用CRISPR 系统进行基因重组donor 质粒构建

该系统可用于sgRNA剪切效果的检测。与SSA 系统不同的是，需要额外转染donor 质粒进行同源重组，即可恢复mCherry的活性。同时，可根据客户的需要，将特定的基因通过donor 的方法敲入到指定位点，进行基因敲入（敲除）的服务。