酵母操作手册LeaderinBiomedicineRDOutsourcing

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2020年4月19日

文档仅供参考，不当之处，请联系改正。

酵母操作手册

（一）酵母的冻存、复苏以及培养

注：本手册改编自商业化酵母操作方案，依据本实验条件修改，

并不适合所有实验室！

培养基配方：

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2020年4月19日

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1．长期冻存：

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2020年4月19日

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无营养缺陷型的酵母株存在含25％甘油的YPDA中，然后冻存于-70℃冰箱中，若要保存大于一年，务必使温度不要低于-55℃。

转染质粒的营养缺陷型酵母株存在含25％甘油的相应的缺陷型培养基（SD）中，以避免质粒丢失。

制备方法：

用无菌牙签从琼脂板上将一个单克隆挑出，置于含200－

500μlYPDA或SD的1.5ml离心管中，注意尽量使牙签上的菌落都涮在溶液中，然后盖好盖，在旋涡器上剧烈振荡混匀，再加入无菌甘油，使其终浓度为25％，再次振荡混匀，存于-70℃冰箱中。2．复苏：

准备一无菌1.5ml离心管，加入100-200μl YPDA或SD，用无菌牙签挑取些许冻存菌置于离心管中，稍微涮洗一下牙签（让挑取的冰屑融化），混匀后吸取100μl涂平板，30℃培养2－3天。

刚长出克隆的平板用封口膜密封后，在4℃可保存1－2个月。

注意：有时冻存的酵母可能沉到离心管底部，因此在复苏时，将其全部融化，然后振荡混匀，再复苏。

3．酵母的液体培养：

用无菌牙签挑取一个两个月以内的酵母克隆，每5ml液体培养基所需的克隆大小为2－3mm，因此，如果单个克隆不够，能够多

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挑几个。剧烈振荡，使酵母细胞分散到液体中，30℃，200rpm振荡培养16－18hr，但一般仿佛需要24hr，甚至更长才能达到稳定期（OD600 > 1.5），因此一般在上午开始摇，第二天下午收。

如果需要中期培养物，则将上面的稳定期培养物稀释到OD600 = 0.2-0.3之间，然后30℃，200rpm振荡培养3－5hr，此时的培养物OD600 = 0.4-0.6之间。可见酵母的细胞周期约为3－5hr。

（二）质粒转化酵母细胞手册

试剂配方：

单链Carrier DNA （SS-DNA）(2 mg/ml)

注意：你不需要将Carrier DNA超声切割，因为实验证明Carrier DNA越大效果越好！只要如下操作即可。

1．称取200mg高分子量DNA（III型脱氧核糖核酸钠盐，鲑鱼精DNA，Sigma D1626），溶于100ml TE（10mM Tris.HCl, PH 8.0,

1.0mM EDTA）。先用10ml枪头吹吸使DNA湿化，然后用磁性

转子于4℃缓慢搅拌过夜使其完全溶解；如果紧急，也可于室温剧烈搅拌2 – 3hr使其完全溶解。

2．将其直接分装成1ml/管，储存在-20℃。

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