中性粒细胞分离实验步骤

中性粒细胞分离实验步骤

一、中性粒细胞初步分选

试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP16４0、1５mｌ离心管4支,棉球,止血带、碘伏、采血针,５mlEＤTA抗凝采血管2支。1mｌ枪及枪头.

分离步骤:

1.所有试剂恢复至室温;

2.EDTA抗凝采血管收集人外周血10mｌ;

3.分别将5mｌ外周血加入５mｌ人淋巴细胞分离液中（15ml离心管中进行)；

注意动作轻柔缓缓加入;

4.５00g离心,3０-３5分钟,室温；

5.离心后收集低带中性粒细胞，分两层,第一层为单核细胞,第二层为中性粒细

胞;(若离心后分层不明显则多离心5—10分钟)

6.将RP１6４０用纯水稀释为50％RP１64０用于重悬中性粒细胞,恢复细胞活

性。(5-１0分钟)

7.４00g离心10分钟,去上清，收集中性粒细胞，重悬于ＲP16４0中,细胞计数。

二、中性粒细胞磁珠分选

试剂耗材及设备：磁力分选器,磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1６４０，1ｍl枪及枪头,２0微升枪与枪头,１5ｍl离心管4支，细胞计数板。步骤:

1.制冰,保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在４—8℃内进行分选；

2.配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mmｏl/L EDＴA,０.5%BＳA，P

Ｈ=7。2);

3.将上步初步分选的中性粒细胞悬液300g离心10分钟，去上清;

4.细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，１0７细胞重悬于80微升缓冲液中；(如细胞

数多按倍数增加)

5.10７细胞中加入20微升ＣD15磁珠;充分混匀放入２—８℃避光孵育１5分钟;

6.用1—2ｍl缓冲液洗涤细胞／107细胞，300g离心10分钟,去上清；

7.重悬细胞于缓冲液中,108细胞重悬于5０0微升缓冲液中;

8.将磁力分选器置于冰盒中,用３ｍｌ缓冲液冲洗磁柱;

9.将含有中性粒细胞的缓冲液加入磁柱中;

10.用缓冲液冲洗磁柱，每次３ml,冲洗3次;

11.除去磁场,把磁柱放置于１5ｍｌ离心管上，用5ml缓冲液加压快速冲洗磁柱;

12.离心管中收集的便是中性粒细胞；

13.30０g离心去上清，重悬细胞于1０ml细胞培养液中,细胞计数。

三、细胞活力检测

中性粒细胞分离实验步骤

步骤：

1、4%台盼蓝母液：称取4ｇ台盼蓝,加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至1０0ml，用滤纸过滤4度保存。使用时.用PＢS稀释至０.４％.

2、胰酶消化贴壁细胞,制备单细胞悬液,并作适当稀释.

３、染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9：1混合混匀。(终浓度0．０4％) 4、计数:在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。

５、镜下观察,死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

6、统计细胞活力:活细胞率（％)= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数)×１０0%

四、细胞分组铺板给药

试剂耗材及设备:六孔板2个，1ml枪及枪头,２0微升枪与枪头，１５ml离心管4支，细胞计数板.

1. 10ml外周血大概可分出1×107个细胞；

２．分为10组：

①空白组②单ＰI组③单A V组

④ＰI、AＶ双染组⑤ＰI、A V、CD15三染组

⑥ＬＰS１μｇ/ｍl组⑦LＰS+Nec—1 50μg/ｍl组⑧LPS+Nｅc-1 5μｇ/mｌ组

⑨Neｃ-1 50μg／mｌ组⑩Ｎｅc—１5μg/ml组.

3。铺板,每孔1mｌ细胞悬液，给药,空白组给予DMSO.（LPS浓度选择1μｇ/ｍl,因为此浓度刺激中性粒细胞后出现凋亡率较低,坏死率较高。Ｎec－１浓度作用于神经细胞为7μｇ／ml—50μg／mｌ）

五、细胞凋亡率检测

耗材试剂：1ml枪及枪头,20微升枪与枪头,1.5mｌ离心管15个，凋亡检测试剂盒,CD15抗体.

１．细胞培养一段时间后（3、6、12、2４、36小时)，离心(20０0ｒpm离心5min）收集细胞;

2. 用PBS 洗涤细胞二次(200０rpｍ离心5min）收集1~5×１0５细胞;

3. 加入500μL 的BinｄiｎｇBuffeｒ悬浮细胞；

4．加入5μL A V 混匀后，加入5 μL PI,混匀;

５．室温、避光、反应５~15ｍin；

6．上机检测,分析结果。